CÔNG NGHỆ SINH học THỰC vật TRONG y dược

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (239.61 KB, 20 trang )

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT TRONG Y DƯỢC
I.

II.

Đặt vấn đề
Y dược là ngành quan trọng đối với đời sống. Thế giới đang
bước vào thời đại khoa học công nghệ với mục tiêu nâng cao chất
lượng cuộc sống, trong đó sức khỏe là luôn lĩnh vực quan trọng
nhất. Các công trình nghiên cứu khoa học – công nghệ sinh học
chung và công nghệ sinh học thực vật nói riêng áp dụng trong y
dược vào thời gian gần đây đã góp phần đưa y học Việt Nam phát
triển lên một tầm cao mới.
Công nghệ sinh học thực vật hiện nay được phát triển và ứng
dụng rộng rãi, giải quyết tốt các vấn đề trong y dược. Giúp nghiên
cứu, phát triển các loại thuốc và các dạng bào chế mới, sử dụng tài
nguyên thiên nhiên và các hợp chất tổng hợp một cách có hiệu quả
nhất. Phát triển các sản phẩm y dược là mục tiêu quan trọng hàng
đầu trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe.
Các hướng ứng dụng chính của công nghệ sinh học thực vật trong
y dược
1. Nuôi cấy mô, cơ quan tế bào thực vật trong y dược

Nhân giống và phát triển những dược liệu quý trên diện rộng
(tạo ra số lượng cây nhiều hơn so với việc phát triển trong tự nhiên
). Việt Nam là nước giàu về tài nguyên dược liệu. Nhiều cây thuốc
quý đã được sử dụng chữa bệnh từ rất lâu đời. Nhờ sự kết hợp với
công nghệ sinh học trong thực vật, di truyền chọn giống, công
nghệ cao trong canh tác, nhiều cây dược liệu đã được nhân và
trồng đại trà. Nhờ vào việc sản xuất đại trà mà rất nhiều loại thực
phẩm chức năng có tính điều trị và phòng bệnh ra đời mang lại

hiệu quả kinh tế cao, cũng từ đó các sản phẩm tạo ra có giá thành
rẻ nhưng chất lượng tốt, góp phần chăm sóc sức khỏe người dân.
Đây là lĩnh vực kinh tế lớn rất được xã hội quan tâm phát triển
trong tương lai.
Bảo tồn và lưu trữ những nguồn gen của cây dược liệu quý.
Chúng ta chưa thể khai thác hết tài nguyên dược liệu hiện có trong

nước và trên thế giới. Việc chọn lựa cây dược liệu quý, có tính
chữa bệnh rõ ràng, và có tính kinh tế cao cần được ưu tiên. Việc
ứng dụng dược liệu cần được đánh giá bằng nghiên cứu khoa học.
Vấn đề bảo tồn các cây giống và nghiên cứu tạo giống mới có hàm
lượng hoạt chất cao hơn cần phải được quan tâm. Ngoài ra, công
nghệ sinh học thực vật còn góp phần Duy trì và mở rộng sự đa
dạng sinh học thực vật dược liệu.
Các kỹ thuật nuôi cấy mô, cơ quan tế bào thực vật trong y dược
+ Nuôi cấy phôi in vitro
Vd: Tạo và nhân phôi soma trong sâm ngọc linh trong môi trường
lỏng
+ Nuôi cấy mô cơ quan tách rời
Vd: Nuôi cấy mô lá đinh lăng tạo rễ tơ trong
+ Nuôi cấy mô phân sinh
Vd: Nuôi cấy mô cây sâm dây
+ Nuôi cấy bao phấn
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast (tế bào trần)

2.

Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học dùng làm
dược liệu rất có giá trị. Những sản phẩm này, được biết như là các
chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường được sản
xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) trong thực vật và không có
chức năng trao đổi chất rõ ràng1. Chúng dường như là sản phẩm
của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung
quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ
hóa học chống lại vi sinh vật và động vật.
Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực
vật ngoại sinh từ cây hoàn chỉnh được nuôi cấy dịch huyền phù
(suspension culture) trong điều kiện vô trùng. Cơ sở của kỹ thuật

nuôi cấy mô thực vật dựa trên tính toàn thể hóa sinh (biochemical
totipotency) duy nhất của tế bào thực vật. Nhiều sản phẩm trao đổi
chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất
lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh. Có nhiều bằng chứng cho
thấy có mối quan hệ ngược (feedback) giữa tốc độ sinh trưởng và
sản xuất các chất thứ cấp. Khi tốc độ sinh trưởng cao, các quá trình
sơ cấp của tế bào là phân chia tế bào và sản xuất sinh khối tế bào.
Trong pha tĩnh, khi sự sinh trưởng giảm đến mức tối thiểu, sự sản
xuất và tích lũy các chất thứ cấp sẽ tăng lên.
Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có
thể xếp trong ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu và
glycoside.Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa
nitrogen, có thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid 3.
Alkaloid có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng
trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine,
caffeine và morphine. Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid và
được sử dụng như là chất mùi, chất thơm và dung

môi. Glycoside bao gồm các phenolic, tanin và flavonoid, saponin
và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng
làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm.

a.

Các alkaloid

Người ta cũng có thể thu được các chất như caffein từ nuôi
cấy tế bào cây Coffea arabica, betalain trong callus củ cải đường,
berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ
4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể berberi n trong rễ, so
với hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương pháp
nuôi cấy tế bào)… Những chất này được sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp hương liệu và trong y học.
Chất reserpine có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối
loạn tuần hoàn cũng được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế

bào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào của cây này trong
30 ngày trong hệ lên men quy mô lớn có thể sản xuất được 3.500
kg reserpine, tương đương với lượng hàng năm của cả thế giới thu
được từ rễ cây đó.
Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based,
Thụy Sĩ) đã sản xuất được loại alkaloid là scopolamine từ tế bào
cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có
cánh khuấy. Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ
thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng và kỹ thuật gen, người
ta đã tăng được sản lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần.
Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của

cây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây
dược liệu bình thường. Một số nghiên cứu đã phân lập được các
dòng tế bào Cantharanthus sản xuất serpentin và ajmalacine từ
nuôi cấy in vitro. Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt người ta
đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tế bào tốt nhất lên
một mức cao hơn nữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg/L
serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264
mg/L ajmalacine. Mới đây người ta đã hoàn thiện được công nghệ
nuôi cấy tế bào của câyCatharanthus roseus để sản xuất viblastine
và vincristine là hai chất kháng ung thư rất mạnh, hiện đang có nhu
cầu rất cao vì chúng được sử dụng để chữa ung thư máu.
Sikuli và cs (1997) sau khi gây nhiễm cây Datura
stramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy hàm
lượng hyoscyamine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy < 100
mg/L.
b.

Các steroid

Trong lĩnh vực steroid và chuyển hóa steroid, các dòng tế bào có
năng suất cao đã được Kaul và cs đề cập đến từ năm 1969. Họ đã
nuôi cấy thành công tế bào của cây Dioscorea deltoidea để sản

xuất diosgenin, là nguyên liệu thô chủ yếu để sản xuất các steroid
chống thụ thai và các hormone tuyến thượng thận.
Quá trình chuyển hóa các hợp chất glycoside tim (cardiac) bằng
nuôi cấy tế bào của cây Digitalis lanata cũng đã được nghiên cứu.
Người ta nhận thấy, mặc dù các tế bào Digitalis ngừng sản xuất
glycoside tim nhưng chúng vẫn có khả năng hydroxyd hóa

digitoxin ở nguyên tử 12C để tạo ra digoxin. Digoxin là một hợp
chất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóa
xảy ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu quả khi đưa vào
môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày, người
ta đã thu được 4 g β-methyl-digitoxin trong một bình nuôi dung
tích 20 L.
c.

Một số chất khác

Thí dụ điển hình nhất là công nghệ sản xuất shikonin, một loại
sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ của
câyLithospermum erythrorhizon. Bình thường shikonin tích lũy
không nhiều trong rễ. Tuy nhiên các nhà khoa học Nhật đã tạo
được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến
15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất
shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu
hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của
shikonin.
Hàm lượng tương đối cao của ubiquinone-10 được tìm thấy
trong tế bào thuốc lá nuôi cấy in vitro và của L-dopa trong môi
trường nuôi cấy tế bào Mucuma pruriens.
Nuôi cấy tế bào của cây Panax pseudoginseng đã cho hàm
lượng saponin khá cao. Nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhiza
glabra đã thu được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng
khô.

Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất được tìm thấy trong nuôi cấy
tế bào của cây Coleus blumei đó là chất rosmarinic acid chiếm 1315% trọng lượng khô trong chu kỳ nuôi 13 ngày, lớn gấp 5 lần so

với hàm lượng trong cây trồng ở điều kiện tự nhiên.
Trong những năm 1980, người ta cũng đã sản xuất rất có hiệu
quả ginsengoside là họat chất chủ yếu của nhân sâm Panax
ginseng.
Các anthraquinone là một nhóm các sản phẩm tự nhiên quan
trọng có ở vi khuẩn, nấm, địa y và thực vật bậc cao có các họat
tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng nấm, giảm huyết áp, giảm
đau, chống sốt rét chống oxy hóa, kháng bệnh bạch cầu và các
chức năng đột biến.
Ở thực vật bậc cao, chúng đã được tìm thấy ở rất nhiều họ thực
vật khác nhau, chẳng hạn Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae,
Leguminosae… Nuôi cấy tế bào các loài của họ Rubiaceae đã cho
phép thu được một lượng lớn anthraquinone thậm chí trong một số
trường hợp đã vượt quá hàm lượng anthraquinone ở cây bố mẹ.

3.

Các protein tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp (protein ngoại lai) là protein tự nhiên được
cải biến bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm nâng cao hoặc thay
đổi hoạt tính của chúng. Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng
để sản xuất các sản phẩm tự nhiên cách đây hơn 20 năm và gần
đây hơn chúng được dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp. Các tế
bào thực vật rất thích hợp cho các nguyên liệu tái tổ hợp do chúng
có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản không cần
bổ sung protein. Nếu protein ngoại lai được sản xuất trong nuôi

cấy tế bào và được tiết ra trong môi trường, nhiều hơn phần được

tích lũy trong tế bào, thì việc thu hồi và tinh sạch sản phẩm có thể
được tiến hành mà không có nhiều protein nhiễm bẩn. Các protein
có nguồn gốc thực vật an toàn cho người hơn các protein có nguồn
gốc từ tế bào động vật bởi vì các chất nhiễm bẩn và virus thực vật
không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Ngoài ra, nuôi cấy tế bào
thực vật cũng là một công cụ thực nghiệm thuận lợi cho việc khảo
sát sự sản xuất protein ngoại lai trong cây hoàn chỉnh.
Thực vật chuyển gen hiện nay được xem là hệ thống sản xuất
rất kinh tế cho việc sản xuất các protein ngoại lai như kháng thể,
enzyme và hormone. Sản xuất thương mại một số protein của vi
khuẩn và động vật đã được tiến hành bằng thực vật. Yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của sản xuất protein dựa trên
cơ sở thực vật là hiệu suất của protein ngoại lai hoặc nồng độ của
sản phẩm được tích lũy trong sinh khối. Theo đó, người ta đã chú ý
cải thiện sự biểu hiện gen ngoại lai trong cây chuyển gen thông
qua việc phát triển các promoter tốt hơn, chọn lọc các dòng chuyển
gen ổn định, và ức chế gen im lặng (silence gene). Tuy nhiên, một
yếu tố quan trọng là sự đứt gãy protein ngoại lai đã làm giảm nồng
độ của sản phẩm chức năng trong mô thực vật sau khi các phân tử
được tổng hợp và lắp ráp. Sự đứt gãy protein ngoại lai đã làm bẩn
sản phẩm với các đoạn protein mất hoạt tính, và người ta cũng gặp
khó khăn khi loại bỏ các protein đứt gãy này trong các hoạt động
thu hồi protein chức năng ở sản xuất quy mô lớn. Tìm hiểu chi tiết
về vị trí và cơ chế của sự đứt gãy ở nội và ngoại bào là rất cần thiết
để có thể phát triển phương pháp sao cho giảm thiểu được sự tổn
thất protein sau dịch mã.
Ứng dụng cụ thể của CNSHTV trong y dược

III.

TẠO VÀ NHÂN PHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH TRONG MÔI
TRƯỜNG LỎNG
1.

Quy trình chung

lá chết
+ 1mg/l
– D +2,4
0,2– mg/l
kinetin)
yền
phù(MS
tế bào
(MS +2,4
1mg/l
D +Nuôi
0,2
lỏng
mg/lhuyền
phôi
kinetin)
cấu
500mg/l
cụm
casein
trưởng
hydrolysate
thành

trong
tamthành
giác 250ml
+ 1-2 mg/l
Tạo
phù+tạo
phôi
cầuphôi
(B5
+Nuôi
3mg/l
IBA)
lỏng
cụm
phôibình
trưởng
trong (SH
bioreactor
3l vàNA
5

Nuôi lỏng mô sẹo có khả năng sinh phôi trong bioreactor 3L và
Nuôi
môvà
sẹo
có khả
250ml
ô sẹo có khả năng sinh phôi
từ lỏng
lá mầm

phôi
nonnăng sinh phôi t trong bình tam giác(1/2SH
+ 10% nước dừa)
(MS + 10% nước dừa + 0,2 mg/l IBA) (1/2SH có và không có 10% nước dừa)

2.

Quy trình cụ thể

a.

Khử trùng mẫu, chuẩn bị mẫu cấy và tạo mô sẹo xốp từ lá cây
in vivo

–

–

Lá chét của cây sâm 6 tháng tuổi (từ củ) ở vườn ươm
được rửa sạch bằng nước máy trong 10 phút.
sau đó được khử trùng lần lượt bằng:
+ cồn 70% trong 1 phút
+ nước Javel thương mại 20% (v/v, có bổ sung Tween 20 hai giọt/100ml dung dịch) trong 10 phút
+ dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) trong 5 phút.

–

–

b.
–

–

–

–

Lá đã khử trùng được cắt thành các mảnh kích thước 0,5 x
0,5cm và cấy trên môi trường thạch MS (Murashige and
Skoog, 1962) có 1 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l kinetin theo chiều
mặt trên của lá hướng lên để tạo mô sẹo.
Ghi nhận kết quả thí nghiệm sau khoảng 1,5 tháng nuôi.
Sau đó, cấy chuyển mô sẹo trong khoảng 4 tháng (1
lần/tháng) trên cùng môi trường để tạo mô sẹo xốp.
Tạo huyền phù tế bào và huyền phù phôi dạng cầu (phôi sơ cấp)
Để tạo huyền phù tế bào (HPTB), nuôi lắc 2g mô sẹo xốp
trong bình tam giác (250ml) chứa 50ml môi trường MS có
1 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l kinetin và 500 mg/l casein
hydrolysate
Dùng que cấy ép nhẹ mô sẹo vào thành bình tam giác để
mô rã và treo vào môi trường thành huyền phù
(suspension) tế bào khởi nguyên.
Sau 2 tháng nuôi, huyền phù tế bào được chuyển sang
nuôi cấy trong môi trường B5 (Gamborg, 1968) lỏng lắc
có 3 mg/l IBA để tạo và nhân huyền phù phôi cầu
(HPPC). Ghi nhận sự hình thành phôi cầu đồng thời loại
bỏ dần tế bào/cụm tế bào không sinh phôi theo thời gian
từ 2 tháng nuôi cấy trở đi.

Phôi dạng cầu có thể phát triển thành phôi trưởng thành
và tạo chồi khi được cấy chuyển sang môi trường thạch
1/2MS + 0,5 mg/l BA + 1 mg/l GA3; môi trường nuôi cấy
từ phôi: 1/2MS có bổ sung 0,5 mg/l BA, 1 mg/l IBA và
500 mg/l than hoạt tính.

c.

–

–

–

d.
–

–

e.

–

–

–

Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ nuôi cấy lá màm (cotyledon) và
phôi non

mục đích tạo nguồn vật liệu mô sẹo sinh phôi cho nghiên
cứu nuôi nhân bằng môi trường lỏng.
Cấy các mảnh lá mầm (dài khoảng 0,8cm) từ cây mầm
(phôi có đầy đủ chồi và rễ) và phôi non in vitro (dài
khoảng 1cm, có rễ nhưng chưa có lá mầm) trên môi
trường thạch MS có 10% nước dừa, có và không có 0,2
mg/l IBA.
Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mô sẹo sinh phôi và phôi
(có hai lá mầm) sau 3 tháng nuôi.
Nuôi phôi dạng cầu trong môi trường lỏng tạo sinh khối cụm
phôi trưởng thành (có lá mầm và rễ mầm)
Cấy 2 g mô phôi cầu vào bình tam giác 250ml chứa 50ml
môi trường SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) có NAA (1
và 2 mg/l) và IBA (1 và 2 mg/l).
Ghi nhận kết quả sau 2,5 tháng nuôi. Cụm mô phôi có rễ
tạo được dùng làm vật liệu nuôi cấy bằng bioreactor.
Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi trong bình tam giác và bằng
bioreactor:
Cấy nuôi 5g (5% – w/v) mô sẹo sinh phôi vào bình tam
giác 250ml chứa 100ml môi trường 1/2SH không có và có
10% nước dừa.
Cấy nuôi 50g mô vào bioreactor dạng cầu/trụ (3 và 10 lít)
với dung tích (2 lít và 5,5 lít, theo thứ tự) môi trường
1/2SH có 10% nước dừa.
Ghi nhận kết quả sau 1 tháng nuôi trong bioreactor bằng

cách cân trọng lượng tươi (g).
f.
–

g.
–

–

Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor
Cấy 50 g mô cụm phôi trưởng thành vào bioreactor dạng
cầu (3 và 5 lít) chứa 2 lít – 2,5% (w/v) và 3,5 lít – 1,5%
(w/v), theo thứ tự, môi trường SH có 1 mg/l và 2 mg/l
IBA. Ghi nhận kết quả sau 1 tháng nuôi cấy.
Điều kiện nuôi cấy
Để ở điều kiện sáng (10 giờ chiếu sáng/ngày; cường độ
sánh sáng  2.000 – 3.000lux tùy trường hợp), nhiệt độ 25 28C đối với nuôi mô sẹo sinh phôi, cụm phôi có rễ,
chồivà cây.
Để tối ở nhiệt độ24 0C trong tủ nuôi đối với nuôi tạo và
nhân mô sẹo.
Nuôi lắc được thực hiện ở tốc độ 110 vòng/phút. Nuôi
bioreactor dùng tốc độ thổi khí 0,1vvm

Hình 1. Tạo huyền phù tế bào từ nuôi cấy mô sẹo xốp
trong môi trường lỏng lắc
a.

Sự hình thành mô sẹo từ mảnh lá chét nuôi cấy in vitro,
sau 1,5 tháng; b. Mô sẹo xốp dùng nuôi cấy tạo huyền
phù tế bào; c. Huyền phù tế bào sau 1 tháng nuôi cấy; d.

Huyền phù tế bào đã được nuôi nhân ổn định (trong bình

tam giác 500ml)

Hình 2. Tạo huyền phù phôi dạng cầu từ huyền phù tế bào

Ghi chú : a. Quần thể các cụm tế bào huyền phù sau 1 tháng nuôi
cấy; b. Cận cảnh cụm đa bào trong nuôi cấy; c. Sự hình thành
bước đầu các cụm đa bào có khả năng sinh phôi (vị trí mũi tên);
d. Giai đoạn đầu của sự hình thành phôi; e. Thể phôi
soma
dạng cầu (C) và dạng tim (T) gần hoàn chỉnh hình thành sau 4
tháng nuôi cấy huyền phù tế bào; f. Quần thể phôi soma chủ yếu
dạng cầu hình thành sau 5 tháng nuôi cấy (hình a, c, d: quan sát
mẫu dưới kính hiển vi soi nổi, vật kính 4X; hình b,e: quan sát
mẫu dưới kính hiển vi soi ngược, vật kính 20X

Hình 3: Quá trình phát triển của phôi soma từ dạng cầu đến gia
đoạn cây hoàn chỉnh
Ghi chú : a. Quần thể phôi cầu trong môi trường lỏng; b. Phôi
ở các giai đoạn dạng tim, thủy lôi và có cực rễ nuôi cấy trong
môi trường lỏng; c. Quần thể phôi trưởng thành với rễ phát
triển trong môi trường lỏng; d, e, f. Sự phát triển của phôi
trưởng thành tạo cây con hoàn chỉnh; f. Cây phát triển có
nguồn gốc từ phôi đơn (thanh ngang 1mm

Hình 4: Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ lá mầm nuôi cấy in vitro
Ghi chú : a. Cắt thu lá mầm từ cây mầm làm vật liệu nuôi cấy
(nơi thanh chéo là vị trí cắt); b. Lá mầm sau 15 ngày nuôi
cấy; c. Sự hình thành phôi đơn và cụm phôi trên bề mặt lá

mầm (quan sát dưới kính hiển vi soi nổi dùng vật kính 4X); d,
e, f. Sự phát triển theo thời gian tạo quần thể lớn phôi có lá
mầm trên môi trường không có IBA; g. Sự hình thành đồng
thời mô sẹo sinh
phôi (vị trí mũi tên)
và phôi có lá mầm
ở mẫu nuôi cấy trên
môi trường có IBA

Hình 5. Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ phôi
non nuôi cấy in vitro

Ghi chú : a. Phôi non dùng nuôi cấy; b. Sự hình thành MSSP và
các ‘nốt’ mô tròn nhỏ sau 1,5 tháng nuôi cấy trên môi trường có
IBA; c. Sự hình thành MSSP và phôi ở vị trí đầu phôi; d. Sự hình
thành phôi ở vị trí đầu phôi và thân phôi; e. Sự hình
thành
phôi ở vị trí đầu phôi và rễ phôi; f. Một cụm phôi soma điển hình
hình thành qua nuôi cấy trên môi trường không có
IBA, sau 3
tháng; g. Cụm phôi với lá mầm và chồi phát triển ở giai đoạn
nuôi cấy tiếp theo

Hình 6. Tạo cụm mô phôi có rễ trong môi trường lỏng lắc
Ghi chú : a. Vật liệu phôi dạng cầu dùng làm thí nghiệm; b, c.
Sự tăng sinh khối của phôi cầu trong môi trường có 1 mg/l
NAA và 2 mg/l NAA, theo thứ tự; d, e, f. Sự tăng sinh khối
của phôi cầu trong môi trường không có chất điều hòa sinh

trưởng (đối chứng), 1mg/l IBA và 2 mg/l IBA, theo thứ tự;
g,h,i. Hình phóng đại của các phôi lần lượt trong môi trường
không có IBA,
1mg/l IBA và 2 mg/l IBA (quan sát dưới
kính hiển vi soi nổi dùng vật kính 4X)

Hình 7: Nuôi lỏng mô sẹo lắc nhân sinh phôi trong bình tam giác
a. Mô sẹo sinh phôi dùng nuôi cấy; b. Mô sẹo sinh phôi nuôi cấy
trong môi trường 1/2SH, sau 2 tháng; c. Mô sẹo sinh phôi nuôi
cấy trong môi trường 1/2SH có 10% nước dừa, sau 2 tháng; d.
Mô phôi giai đoạn có lá mầm dùng nuôi cấy; e. Mô phôi giai
đoạn tạo lá mầm nuôi cấy trong môi trường 1/2SH, sau 2 tháng;
f. Mô phôi giai đoạn tạo lá mầm nuôi cấy trong môi trường
1/2SH có 10% nước dừa, sau 2 tháng; g, h, i. Cận cảnh sự hình
thành các ‘nốt’ mô nhỏ trên bề mặt cụm mô sẹo sinh phôi và
phôi có rễ trong quá trình nuôi cấy lỏng (vị trí mũi tên)

Hình 8: Nuôi nhân mô sẹo sinh khối bằng bioreacteor 3L và
10L chứ môi trường 1/2SH có 10% nước dừa.
Ghi chú: a. Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi bằng bioreactor
dạng cầu 3 lít, sau 1 tháng nuôi cấy; b. Nuôi nhân mô sẹo
sinh phôi bằng bioreactor dạng cầu 10 lít, sau 1 tháng nuôi
cấy (vị trí mũi tên chỉ mức khởi điểm lượng sinh khối mô ở
ngày nuôi cấy đầu tiên)

Hình 9. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor 3 lít và 5 lít
Ghi chú : a. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor dạng trụ
3 lít, sau 1 tháng nuôi cấy trong môi trường SH có 1 mg/l IBA; b.

Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor dạng cầu 5 lít, sau 1

tháng nuôi cấy trong môi trường có 2 mg/l IBA (vị trí mũi tên
chỉ mức khởi điểm lượng sinh khối mô ở ngày nuôi cấy đầu tiên).
IV.

Tài liệu tham khảo
1
– Mai Trường
, Trần Thị Ngọc Hà 1, Trần Trọng Tuấn 1, Phan
Tường Lộc 1, Đỗ Đăng Giáp 1, Bùi Đình Thạch 1, Nguyễn Thị
Ngọc Hân 1, Phạm Đức Trí 1, Lê Tấn Đức 1, Nguyễn Đức Minh
Hùng 1, Nguyễn Văn Kết 2, Nguyễn Hữu Hổ – TẠO VÀ NHÂN
PHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG.
– Phạm Thị Minh Thu – Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật.

DANH SÁCH NHÓM 4 – 56SH1
1.
2.
3.
4.

Hồ Mỹ Duyên – Nhóm trưởng.
Hồ Thị Xuân Diệu.
Nguyễn Thảo Hiền.
Nguyễn Văn Sơn.

hiệu suất cao kinh tế tài chính cao, cũng từ đó những loại sản phẩm tạo ra có giá thànhrẻ nhưng chất lượng tốt, góp thêm phần chăm nom sức khỏe thể chất người dân. Đây là nghành kinh tế tài chính lớn rất được xã hội chăm sóc phát triểntrong tương lai. Bảo tồn và tàng trữ những nguồn gen của cây dược liệu quý. Chúng ta chưa thể khai thác hết tài nguyên dược liệu hiện có trongnước và trên quốc tế. Việc lựa chọn cây dược liệu quý, có tínhchữa bệnh rõ ràng, và có tính kinh tế tài chính cao cần được ưu tiên. Việcứng dụng dược liệu cần được nhìn nhận bằng nghiên cứu và điều tra khoa học. Vấn đề bảo tồn những cây giống và nghiên cứu và điều tra tạo giống mới có hàmlượng hoạt chất cao hơn cần phải được chăm sóc. Ngoài ra, côngnghệ sinh học thực vật còn góp thêm phần Duy trì và lan rộng ra sự đadạng sinh học thực vật dược liệu. Các kỹ thuật nuôi cấy mô, cơ quan tế bào thực vật trong y dược + Nuôi cấy phôi in vitroVd : Tạo và nhân phôi soma trong sâm ngọc linh trong môi trườnglỏng + Nuôi cấy mô cơ quan tách rờiVd : Nuôi cấy mô lá đinh lăng tạo rễ tơ trong + Nuôi cấy mô phân sinhVd : Nuôi cấy mô cây sâm dây + Nuôi cấy bao phấn + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast ( tế bào trần ) 2. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bàoThực vật là nguồn cung ứng những hợp chất hóa học dùng làmdược liệu rất có giá trị. Những mẫu sản phẩm này, được biết như là cácchất trao đổi thứ cấp ( secondary metabolites ), thường được sảnxuất với một lượng rất nhỏ ( dạng vết ) trong thực vật và không cóchức năng trao đổi chất rõ ràng1. Chúng có vẻ như là sản phẩmcủa những phản ứng hóa học của thực vật với môi trường tự nhiên chungquanh, là sự thích nghi với stress của môi trường tự nhiên hoặc là sự bảo vệhóa học chống lại vi sinh vật và động vật hoang dã. Để sản xuất những loại sản phẩm thứ cấp từ thực vật, những mô thựcvật ngoại sinh từ cây hoàn hảo được nuôi cấy dịch huyền phù ( suspension culture ) trong điều kiện kèm theo vô trùng. Cơ sở của kỹ thuậtnuôi cấy mô thực vật dựa trên tính toàn thể hóa sinh ( biochemicaltotipotency ) duy nhất của tế bào thực vật. Nhiều mẫu sản phẩm trao đổichất hoàn toàn có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chấtlượng cao hơn trong cây hoàn hảo. Có nhiều dẫn chứng chothấy có mối quan hệ ngược ( feedback ) giữa vận tốc sinh trưởng vàsản xuất những chất thứ cấp. Khi vận tốc sinh trưởng cao, những quá trìnhsơ cấp của tế bào là phân loại tế bào và sản xuất sinh khối tế bào. Trong pha tĩnh, khi sự sinh trưởng giảm đến mức tối thiểu, sự sảnxuất và tích góp những chất thứ cấp sẽ tăng lên. Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là những chất thứ cấp cóthể xếp trong ba nhóm chính : alkaloid, tinh dầu vàglycoside. Các alkaloid có dạng tinh thể là những hợp chất chứanitrogen, hoàn toàn có thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid 3. Alkaloid có hoạt tính sinh lý trên toàn bộ động vật hoang dã và được sử dụngtrong công nghiệp dược. Họ alkaloid gồm có : codein, nicotine, caffeine và morphine. Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid vàđược sử dụng như là chất mùi, chất thơm và dungmôi. Glycoside gồm có những phenolic, tanin và flavonoid, saponinvà những cyanogenic glycoside, một số ít trong chúng được sử dụnglàm chất nhuộm, những chất mùi thực phẩm và dược phẩm. a. Các alkaloidNgười ta cũng hoàn toàn có thể thu được những chất như caffein từ nuôicấy tế bào cây Coffea arabica, betalain trong callus củ cải đường, berberin từ tế bào cây Coptis japonica ( loài cây này phải trồng từ4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể berberi n trong rễ, sovới hàm lượng này hoàn toàn có thể thu được sau 4 tuần bằng phương phápnuôi cấy tế bào ) … Những chất này được sử dụng thoáng đãng trongcông nghiệp hương liệu và trong y học. Chất reserpine có công dụng chữa bệnh cao huyết áp và những bệnh rốiloạn tuần hoàn cũng được sản xuất bằng chiêu thức nuôi cấy tếbào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào của cây này trong30 ngày trong hệ lên men quy mô lớn hoàn toàn có thể sản xuất được 3.500 kg reserpine, tương tự với lượng hàng năm của cả quốc tế thuđược từ rễ cây đó. Các nhà nghiên cứu thuộc tổng hợp dược phẩm Gibageigy ( Based, Thụy Sĩ ) đã sản xuất được loại alkaloid là scopolamine từ tế bàocây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không cócánh khuấy. Bằng cách tinh lọc những dòng tế bào cao sản nhờ kỹthuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng và kỹ thuật gen, ngườita đã tăng được sản lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần. Nhiều nghiên cứu và điều tra cho thấy nuôi cấy callus và tế bào củacây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với câydược liệu thông thường. Một số điều tra và nghiên cứu đã phân lập được cácdòng tế bào Cantharanthus sản xuất serpentin và ajmalacine từnuôi cấy in vitro. Bằng loại thiên nhiên và môi trường sản xuất đặc biệt quan trọng người tađã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tế bào tốt nhất lênmột mức cao hơn nữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg / Lserpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg / L serpentin cùng với 264 mg / L ajmalacine. Mới đây người ta đã triển khai xong được công nghệnuôi cấy tế bào của câyCatharanthus roseus để sản xuất viblastinevà vincristine là hai chất kháng ung thư rất mạnh, hiện đang có nhucầu rất cao vì chúng được sử dụng để chữa ung thư máu. Sikuli và cs ( 1997 ) sau khi gây nhiễm cây Daturastramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy hàmlượng hyoscyamine ở rễ đạt cực lớn sau 6 tuần nuôi cấy < 100 mg / L.b.Các steroidTrong nghành steroid và chuyển hóa steroid, những dòng tế bào cónăng suất cao đã được Kaul và cs đề cập đến từ năm 1969. Họ đãnuôi cấy thành công xuất sắc tế bào của cây Dioscorea deltoidea để sảnxuất diosgenin, là nguyên vật liệu thô hầu hết để sản xuất những steroidchống thụ thai và những hormone tuyến thượng thận. Quá trình chuyển hóa những hợp chất glycoside tim ( cardiac ) bằngnuôi cấy tế bào của cây Digitalis lanata cũng đã được điều tra và nghiên cứu. Người ta nhận thấy, mặc dầu những tế bào Digitalis ngừng sản xuấtglycoside tim nhưng chúng vẫn có năng lực hydroxyd hóadigitoxin ở nguyên tử 12C để tạo ra digoxin. Digoxin là một hợpchất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóaxảy ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu suất cao khi đưa vàomôi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày, ngườita đã thu được 4 g β-methyl-digitoxin trong một bình nuôi dungtích 20 L.c.Một số chất khácThí dụ nổi bật nhất là công nghệ sản xuất shikonin, một loạisắc tố đỏ có năng lực diệt khuẩn, có trong rễ củacâyLithospermum erythrorhizon. Bình thường shikonin tích lũykhông nhiều trong rễ. Tuy nhiên những nhà khoa học Nhật đã tạođược dòng tế bào rễ cây Lithospermum có năng lực tích góp đến15 % shikonin và đã hoàn hảo công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuấtshikonin. Công nghệ này được cho phép trong một chu kỳ luân hồi nuôi cấy thuhoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá tiền củashikonin. Hàm lượng tương đối cao của ubiquinone-10 được tìm thấytrong tế bào thuốc lá nuôi cấy in vitro và của L-dopa trong môitrường nuôi cấy tế bào Mucuma pruriens. Nuôi cấy tế bào của cây Panax pseudoginseng đã cho hàmlượng saponin khá cao. Nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhizaglabra đã thu được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4 % trọng lượngkhô. Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất được tìm thấy trong nuôi cấytế bào của cây Coleus blumei đó là chất rosmarinic acid chiếm 1315 % khối lượng khô trong chu kỳ luân hồi nuôi 13 ngày, lớn gấp 5 lần sovới hàm lượng trong cây xanh ở điều kiện kèm theo tự nhiên. Trong những năm 1980, người ta cũng đã sản xuất rất có hiệuquả ginsengoside là họat chất đa phần của nhân sâm Panaxginseng. Các anthraquinone là một nhóm những mẫu sản phẩm tự nhiên quantrọng có ở vi trùng, nấm, địa y và thực vật bậc cao có những họattính sinh học như : kháng khuẩn, kháng nấm, giảm huyết áp, giảmđau, chống sốt rét chống oxy hóa, kháng bệnh bạch cầu và cácchức năng đột biến. Ở thực vật bậc cao, chúng đã được tìm thấy ở rất nhiều họ thựcvật khác nhau, ví dụ điển hình Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae, Leguminosae ... Nuôi cấy tế bào những loài của họ Rubiaceae đã chophép thu được một lượng lớn anthraquinone thậm chí còn trong một sốtrường hợp đã vượt quá hàm lượng anthraquinone ở cây bố mẹ. 3. Các protein tái tổ hợpProtein tái tổng hợp ( protein ngoại lai ) là protein tự nhiên đượccải biến bằng công nghệ DNA tái tổng hợp nhằm mục đích nâng cao hoặc thayđổi hoạt tính của chúng. Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụngđể sản xuất những mẫu sản phẩm tự nhiên cách đây hơn 20 năm và gầnđây hơn chúng được dùng để sản xuất những protein tái tổng hợp. Các tếbào thực vật rất thích hợp cho những nguyên vật liệu tái tổng hợp do chúngcó thể sinh trưởng trên thiên nhiên và môi trường tương đối đơn thuần không cầnbổ sung protein. Nếu protein ngoại lai được sản xuất trong nuôicấy tế bào và được tiết ra trong thiên nhiên và môi trường, nhiều hơn phần đượctích lũy trong tế bào, thì việc tịch thu và tinh sạch mẫu sản phẩm có thểđược thực thi mà không có nhiều protein nhiễm bẩn. Các proteincó nguồn gốc thực vật bảo đảm an toàn cho người hơn những protein có nguồngốc từ tế bào động vật hoang dã chính bới những chất nhiễm bẩn và virus thực vậtkhông phải là tác nhân gây bệnh ở người. Ngoài ra, nuôi cấy tế bàothực vật cũng là một công cụ thực nghiệm thuận tiện cho việc khảosát sự sản xuất protein ngoại lai trong cây hoàn hảo. Thực vật chuyển gen lúc bấy giờ được xem là mạng lưới hệ thống sản xuấtrất kinh tế tài chính cho việc sản xuất những protein ngoại lai như kháng thể, enzyme và hormone. Sản xuất thương mại 1 số ít protein của vikhuẩn và động vật hoang dã đã được thực thi bằng thực vật. Yếu tố quantrọng tác động ảnh hưởng đến hiệu suất cao kinh tế tài chính của sản xuất protein dựa trêncơ sở thực vật là hiệu suất của protein ngoại lai hoặc nồng độ củasản phẩm được tích góp trong sinh khối. Theo đó, người ta đã chú ýcải thiện sự biểu lộ gen ngoại lai trong cây chuyển gen thôngqua việc tăng trưởng những promoter tốt hơn, tinh lọc những dòng chuyểngen không thay đổi, và ức chế gen yên lặng ( silence gene ). Tuy nhiên, mộtyếu tố quan trọng là sự đứt gãy protein ngoại lai đã làm giảm nồngđộ của mẫu sản phẩm công dụng trong mô thực vật sau khi những phân tửđược tổng hợp và lắp ráp. Sự đứt gãy protein ngoại lai đã làm bẩnsản phẩm với những đoạn protein mất hoạt tính, và người ta cũng gặpkhó khăn khi vô hiệu những protein đứt gãy này trong những hoạt độngthu hồi protein tính năng ở sản xuất quy mô lớn. Tìm hiểu chi tiếtvề vị trí và chính sách của sự đứt gãy ở nội và ngoại bào là rất cần thiếtđể hoàn toàn có thể tăng trưởng giải pháp sao cho giảm thiểu được sự tổnthất protein sau dịch mã. Ứng dụng đơn cử của CNSHTV trong y dượcIII. TẠO VÀ NHÂN PHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH TRONG MÔITRƯỜNG LỎNG1. Quy trình chunglá chết + 1 mg / l – D + 2,40,2 – mg / lkinetin ) yềnphù ( MStế bào ( MS + 2,41 mg / lD + Nuôi0, 2 lỏngmg / lhuyềnphôikinetin ) cấu500mg / lcụmcaseintrưởnghydrolysatethànhtrongtamthànhgiác 250 ml + 1-2 mg / lTạophù + tạophôicầuphôi ( B5 + Nuôi3mg / lIBA ) lỏngcụmphôibìnhtrưởngtrong ( SHbioreactor3l vàNANuôi lỏng mô sẹo có năng lực sinh phôi trong bioreactor 3L vàNuôimôvàsẹocó khả250mlô sẹo có năng lực sinh phôitừ lỏnglá mầmphôinonnăng sinh phôi t trong bình tam giác ( 1/2 SH + 10 % nước dừa ) ( MS + 10 % nước dừa + 0,2 mg / l IBA ) ( 1/2 SH có và không có 10 % nước dừa ) 2. Quy trình cụ thểa. Khử trùng mẫu, chuẩn bị sẵn sàng mẫu cấy và tạo mô sẹo xốp từ lá câyin vivoLá chét của cây sâm 6 tháng tuổi ( từ củ ) ở vườn ươmđược rửa sạch bằng nước máy trong 10 phút. sau đó được khử trùng lần lượt bằng : + cồn 70 % trong 1 phút + nước Javel thương mại 20 % ( v / v, có bổ trợ Tween 20 hai giọt / 100 ml dung dịch ) trong 10 phút + dung dịch HgCl2 0,1 % ( w / v ) trong 5 phút. b. Lá đã khử trùng được cắt thành những mảnh kích cỡ 0,5 x0, 5 cm và cấy trên thiên nhiên và môi trường thạch MS ( Murashige andSkoog, 1962 ) có 1 mg / l 2,4 - D ; 0,2 mg / l kinetin theo chiềumặt trên của lá hướng lên để tạo mô sẹo. Ghi nhận tác dụng thí nghiệm sau khoảng chừng 1,5 tháng nuôi. Sau đó, cấy chuyển mô sẹo trong khoảng chừng 4 tháng ( 1 lần / tháng ) trên cùng thiên nhiên và môi trường để tạo mô sẹo xốp. Tạo huyền phù tế bào và huyền phù phôi dạng cầu ( phôi sơ cấp ) Để tạo huyền phù tế bào ( HPTB ), nuôi lắc 2 g mô sẹo xốptrong bình tam giác ( 250 ml ) chứa 50 ml môi trường tự nhiên MS có1 mg / l 2,4 - D ; 0,2 mg / l kinetin và 500 mg / l caseinhydrolysateDùng que cấy ép nhẹ mô sẹo vào thành bình tam giác đểmô rã và treo vào thiên nhiên và môi trường thành huyền phù ( suspension ) tế bào khởi nguyên. Sau 2 tháng nuôi, huyền phù tế bào được chuyển sangnuôi cấy trong thiên nhiên và môi trường B5 ( Gamborg, 1968 ) lỏng lắccó 3 mg / l IBA để tạo và nhân huyền phù phôi cầu ( HPPC ). Ghi nhận sự hình thành phôi cầu đồng thời loạibỏ dần tế bào / cụm tế bào không sinh phôi theo thời giantừ 2 tháng nuôi cấy trở đi. Phôi dạng cầu hoàn toàn có thể tăng trưởng thành phôi trưởng thànhvà tạo chồi khi được cấy chuyển sang thiên nhiên và môi trường thạch1 / 2MS + 0,5 mg / l BA + 1 mg / l GA3 ; thiên nhiên và môi trường nuôi cấytừ phôi : 1/2 MS có bổ trợ 0,5 mg / l BA, 1 mg / l IBA và500 mg / l than hoạt tính. c. d. e. Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ nuôi cấy lá màm ( cotyledon ) vàphôi nonmục đích tạo nguồn vật tư mô sẹo sinh phôi cho nghiêncứu nuôi nhân bằng môi trường tự nhiên lỏng. Cấy những mảnh lá mầm ( dài khoảng chừng 0,8 cm ) từ cây mầm ( phôi có khá đầy đủ chồi và rễ ) và phôi non in vitro ( dàikhoảng 1 cm, có rễ nhưng chưa có lá mầm ) trên môitrường thạch MS có 10 % nước dừa, có và không có 0,2 mg / l IBA.Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mô sẹo sinh phôi và phôi ( có hai lá mầm ) sau 3 tháng nuôi. Nuôi phôi dạng cầu trong thiên nhiên và môi trường lỏng tạo sinh khối cụmphôi trưởng thành ( có lá mầm và rễ mầm ) Cấy 2 g mô phôi cầu vào bình tam giác 250 ml chứa 50 mlmôi trường SH ( Schenk and Hildebrandt, 1972 ) có NAA ( 1 và 2 mg / l ) và IBA ( 1 và 2 mg / l ). Ghi nhận tác dụng sau 2,5 tháng nuôi. Cụm mô phôi có rễtạo được dùng làm vật tư nuôi cấy bằng bioreactor. Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi trong bình tam giác và bằngbioreactor : Cấy nuôi 5 g ( 5 % - w / v ) mô sẹo sinh phôi vào bình tamgiác 250 ml chứa 100 ml môi trường tự nhiên 1/2 SH không có và có10 % nước dừa. Cấy nuôi 50 g mô vào bioreactor dạng cầu / trụ ( 3 và 10 lít ) với dung tích ( 2 lít và 5,5 lít, theo thứ tự ) môi trường1 / 2SH có 10 % nước dừa. Ghi nhận hiệu quả sau 1 tháng nuôi trong bioreactor bằngcách cân khối lượng tươi ( g ). f. g. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactorCấy 50 g mô cụm phôi trưởng thành vào bioreactor dạngcầu ( 3 và 5 lít ) chứa 2 lít - 2,5 % ( w / v ) và 3,5 lít - 1,5 % ( w / v ), theo thứ tự, thiên nhiên và môi trường SH có 1 mg / l và 2 mg / lIBA. Ghi nhận tác dụng sau 1 tháng nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấyĐể ở điều kiện kèm theo sáng ( 10 giờ chiếu sáng / ngày ; cường độsánh sáng  2.000 - 3.000 lux tùy trường hợp ), nhiệt độ 25 28  C so với nuôi mô sẹo sinh phôi, cụm phôi có rễ, chồivà cây. Để tối ở nhiệt độ24 0C trong tủ nuôi so với nuôi tạo vànhân mô sẹo. Nuôi lắc được triển khai ở vận tốc 110 vòng / phút. Nuôibioreactor dùng vận tốc thổi khí 0,1 vvmHình 1. Tạo huyền phù tế bào từ nuôi cấy mô sẹo xốptrong thiên nhiên và môi trường lỏng lắca. Sự hình thành mô sẹo từ mảnh lá chét nuôi cấy in vitro, sau 1,5 tháng ; b. Mô sẹo xốp dùng nuôi cấy tạo huyềnphù tế bào ; c. Huyền phù tế bào sau 1 tháng nuôi cấy ; d. Huyền phù tế bào đã được nuôi nhân không thay đổi ( trong bìnhtam giác 500 ml ) Hình 2. Tạo huyền phù phôi dạng cầu từ huyền phù tế bàoGhi chú : a. Quần thể những cụm tế bào huyền phù sau 1 tháng nuôicấy ; b. Cận cảnh cụm đa bào trong nuôi cấy ; c. Sự hình thànhbước đầu những cụm đa bào có năng lực sinh phôi ( vị trí mũi tên ) ; d. Giai đoạn đầu của sự hình thành phôi ; e. Thể phôisomadạng cầu ( C ) và dạng tim ( T ) gần hoàn hảo hình thành sau 4 tháng nuôi cấy huyền phù tế bào ; f. Quần thể phôi soma chủ yếudạng cầu hình thành sau 5 tháng nuôi cấy ( hình a, c, d : quan sátmẫu dưới kính hiển vi soi nổi, vật kính 4X ; hình b, e : quan sátmẫu dưới kính hiển vi soi ngược, vật kính 20XH ình 3 : Quá trình tăng trưởng của phôi soma từ dạng cầu đến giađoạn cây hoàn chỉnhGhi chú : a. Quần thể phôi cầu trong thiên nhiên và môi trường lỏng ; b. Phôiở những tiến trình dạng tim, thủy lôi và có cực rễ nuôi cấy trongmôi trường lỏng ; c. Quần thể phôi trưởng thành với rễ pháttriển trong thiên nhiên và môi trường lỏng ; d, e, f. Sự tăng trưởng của phôitrưởng thành tạo cây con hoàn hảo ; f. Cây tăng trưởng cónguồn gốc từ phôi đơn ( thanh ngang 1 mmHình 4 : Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ lá mầm nuôi cấy in vitroGhi chú : a. Cắt thu lá mầm từ cây mầm làm vật tư nuôi cấy ( nơi thanh chéo là vị trí cắt ) ; b. Lá mầm sau 15 ngày nuôicấy ; c. Sự hình thành phôi đơn và cụm phôi trên mặt phẳng lámầm ( quan sát dưới kính hiển vi soi nổi dùng vật kính 4X ) ; d, e, f. Sự tăng trưởng theo thời hạn tạo quần thể lớn phôi có lámầm trên môi trường tự nhiên không có IBA ; g. Sự hình thành đồngthời mô sẹo sinhphôi ( vị trí mũi tên ) và phôi có lá mầmở mẫu nuôi cấy trênmôi trường có IBAHình 5. Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ phôinon nuôi cấy in vitroGhi chú : a. Phôi non dùng nuôi cấy ; b. Sự hình thành MSSP vàcác ‘ nốt ’ mô tròn nhỏ sau 1,5 tháng nuôi cấy trên thiên nhiên và môi trường cóIBA ; c. Sự hình thành MSSP và phôi ở vị trí đầu phôi ; d. Sự hìnhthành phôi ở vị trí đầu phôi và thân phôi ; e. Sự hìnhthànhphôi ở vị trí đầu phôi và rễ phôi ; f. Một cụm phôi soma điển hìnhhình thành qua nuôi cấy trên thiên nhiên và môi trường không cóIBA, sau 3 tháng ; g. Cụm phôi với lá mầm và chồi tăng trưởng ở giai đoạnnuôi cấy tiếp theoHình 6. Tạo cụm mô phôi có rễ trong thiên nhiên và môi trường lỏng lắcGhi chú : a. Vật liệu phôi dạng cầu dùng làm thí nghiệm ; b, c. Sự tăng sinh khối của phôi cầu trong môi trường tự nhiên có 1 mg / lNAA và 2 mg / l NAA, theo thứ tự ; d, e, f. Sự tăng sinh khốicủa phôi cầu trong thiên nhiên và môi trường không có chất điều hòa sinhtrưởng ( đối chứng ), 1 mg / l IBA và 2 mg / l IBA, theo thứ tự ; g, h, i. Hình phóng đại của những phôi lần lượt trong môi trườngkhông có IBA, 1 mg / l IBA và 2 mg / l IBA ( quan sát dướikính hiển vi soi nổi dùng vật kính 4X ) Hình 7 : Nuôi lỏng mô sẹo lắc nhân sinh phôi trong bình tam giáca. Mô sẹo sinh phôi dùng nuôi cấy ; b. Mô sẹo sinh phôi nuôi cấytrong thiên nhiên và môi trường 1/2 SH, sau 2 tháng ; c. Mô sẹo sinh phôi nuôicấy trong môi trường tự nhiên 1/2 SH có 10 % nước dừa, sau 2 tháng ; d. Mô phôi quá trình có lá mầm dùng nuôi cấy ; e. Mô phôi giaiđoạn tạo lá mầm nuôi cấy trong thiên nhiên và môi trường 1/2 SH, sau 2 tháng ; f. Mô phôi quá trình tạo lá mầm nuôi cấy trong môi trường1 / 2SH có 10 % nước dừa, sau 2 tháng ; g, h, i. Cận cảnh sự hìnhthành những ‘ nốt ’ mô nhỏ trên mặt phẳng cụm mô sẹo sinh phôi vàphôi có rễ trong quy trình nuôi cấy lỏng ( vị trí mũi tên ) Hình 8 : Nuôi nhân mô sẹo sinh khối bằng bioreacteor 3L và10L chứ thiên nhiên và môi trường 1/2 SH có 10 % nước dừa. Ghi chú : a. Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi bằng bioreactordạng cầu 3 lít, sau 1 tháng nuôi cấy ; b. Nuôi nhân mô sẹosinh phôi bằng bioreactor dạng cầu 10 lít, sau 1 tháng nuôicấy ( vị trí mũi tên chỉ mức khởi điểm lượng sinh khối mô ởngày nuôi cấy tiên phong ) Hình 9. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor 3 lít và 5 lítGhi chú : a. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor dạng trụ3 lít, sau 1 tháng nuôi cấy trong môi trường tự nhiên SH có 1 mg / l IBA ; b. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor dạng cầu 5 lít, sau 1 tháng nuôi cấy trong môi trường tự nhiên có 2 mg / l IBA ( vị trí mũi tênchỉ mức khởi điểm lượng sinh khối mô ở ngày nuôi cấy tiên phong ). IV.Tài liệu tìm hiểu thêm - Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà 1, Trần Trọng Tuấn 1, PhanTường Lộc 1, Đỗ Đăng Giáp 1, Bùi Đình Thạch 1, Nguyễn ThịNgọc Hân 1, Phạm Đức Trí 1, Lê Tấn Đức 1, Nguyễn Đức MinhHùng 1, Nguyễn Văn Kết 2, Nguyễn Hữu Hổ - TẠO VÀ NHÂNPHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH ( Panax vietnamensis Ha etGrushv. ) TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG. - Phạm Thị Minh Thu – Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật. DANH SÁCH NHÓM 4 – 56SH11. 2.3.4. Hồ Mỹ Duyên – Nhóm trưởng. Hồ Thị Xuân Diệu. Nguyễn Thảo Hiền. Nguyễn Văn Sơn .

Source: https://laodongdongnai.vn
Category: Công Nghệ