KĨ THUẬT PCR – MỘT TIẾN BỘ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

PCR là một kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử hiện đại được ứng dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm, phục vụ cho việc chẩn đoán các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng, ung thư, hay phát hiện các đột biến gen… Sự ra đời của PCR đã làm thay đổi hoàn toàn khoa học sinh học kể từ thời điểm nó được phát hiện vào năm 1990

1. Tổng quan về PCR

PCR (viết tắt của Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng của polymerase hay phản ứng khuếch đại gen) là một kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử hiện đại được phát minh đạt giải Nobel (1993) của nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis.

Phương pháp này dựa vào những chu kỳ luân hồi nhiệt để “ khuếch đại ” tạo ra một số lượng lớn những bản sao của ADN. Chỉ từ một lượng ADN rất nhỏ như giọt máu, sợi tóc, mảnh da tế bào … với kỹ thuật PCR hoàn toàn có thể khuếch đại lên hàng triệu bản nhằm mục đích ship hàng cho quy trình khảo sát .

Đây được coi là bước tiến đột phá trong lĩnh vực công nghệ sinh học, được ứng dụng rộng rãi trong y học và nghiên cứu. So với phương pháp truyền thống, xét nghiệm PCR mang lại một kết quả chính xác, trong một thời gian ngắn. hỗ trợ đắc lực cho công tác chẩn đoán và điều trị bệnh.

2. Nguyên lý

Nguyên lý tổng hợp DNA trong cơ thể: ADN là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định lên đặc tính của cơ thể (ngoại trừ virus có vật chất di truyền là ARN). Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi sự có mặt enzym ADN polymerase, các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi ADN khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotid. Trong quá trình nguyên phân, các sợi ADN kép được tháo xoắn và tách thành các sợi DNA đơn. Dưới tác dụng của enzym ADN polymerase, quá trình tổng hợp ADN được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotid vào đoạn mồi, kéo dài theo nguyên tắc bổ sung với mạch ADN khuôn.

Nguyên lý của kỹ thuật PCR – Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzym Helicase .
+ Kết hợp với enzym ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp ADN mới trong môi trường tự nhiên thích hợp .
+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với những đoạn mồi được phong cách thiết kế chuyên biệt, dữ thế chủ động .
+ ADN polymerase có hoạt tính ưa nhiệt, tìm thấy ở vi trùng suối nước nóng .
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ luân hồi tiếp nối đuôi nhau nhau, mỗi chu kỳ luân hồi gồm ba tiến trình : tiến trình biến tính, quá trình bắt cặp, quy trình tiến độ lê dài .

3. Thành phần của một phản ứng PCR

Để triển khai phản ứng PCR, cần có những thành phần như sau :

– Dung dịch ADN mẫu (template) chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh chế sạch để nhân bản.

– Primers: là các đoạn ADN mồi, độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu.

– ADN polymerase: enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban đầu, có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase.

– Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T, G, C) là nguyên liệu cấu tạo nên ADN, ADN polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự ADN bản sao.

– Dung dịch đệm: môi trường hoạt động cho enzyme ADN polymerase

– Ống PCR: dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal cycler).

4. Quy trình

Các thành phần nêu trên được trộn trong một ống nghiệm hoặc đĩa petri có những giếng và sau đó được đặt trong một máy được cho phép lặp lại những chu kỳ luân hồi khuếch đại ADN theo ba bước ( thường từ 25 đến 75 chu kỳ luân hồi ) .

* Giai đoạn biến tính (Denaturation): là giai đoạn tách chuỗi ADN từ sợi đôi thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94-96°C sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi ADN và làm hai sợi ADN tách ra.

* Giai đoạn bắt cặp (Annealing): là giai đoạn gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi ADN tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi ADN đơn.

* Giai đoạn kéo dài (Extension): là giai đoạn tổng hợp chuỗi ADN mới giống chuỗi ADN gốc. ADN polymerase gắn tiếp vào sợi trống, bám vào và hoạt động dọc theo sợi ADN. Các đoạn ADN mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy sau n chu kỳ, theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

5. Ứng dụng của kĩ thuật PCR

Trong suốt hơn 30 năm kể từ khi PCR được sử dụng lần tiên phong, kỹ thuật này đã ảnh hưởng tác động can đảm và mạnh mẽ đến mọi nghành nghề dịch vụ chuyên ngành tương quan đến Khoa học sự sống và Y Sinh học .
– Phát hiện vi trùng, virus và những đột biến gen gây ung thư như gen BRCA1 – BRCA2 trong ung thư vú, virus HPV gây ung thư cổ tử cung, …

– Phát hiện các tác nhân vi sinh vật mà xét nghiệm vi sinh truyền thống không làm được đó là virus viêm gan B, viêm gan C, HIV, HPV, H5N1, Herpes,… các vi khuẩn như Chlamydia, Mycoplasma, Treponema pallidum,… 

– Phát hiện những tác nhân vi sinh gây bệnh 1 cách sớm nhất khắc phục những trường hợp mà tác nhân nhiễm khuẩn không hề nuôi cấy bằng giải pháp thường thì .

– Xác định độc tố của các vi sinh vật gây bệnh như E.coli, vi khuẩn tả Vibrio cholerae,…

Kỹ thuật PCR đã giúp làm đổi khác phương pháp nghiên cứu và nâng cao hiệu suất thao tác của những chuyên ngành từ pháp y, bảo đảm an toàn thực phẩm, chẩn đoán lâm sàng cho đến nghiên cứu hệ gen .
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lilit Garibyan1 and Nidhi Avashia, 2 Journal of Investigative Dermatology ( 2013 ), Polymerase Chain Reaction

2. Polymerase chain reaction (NCBI)

3. Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc. 2003. Xác định giới tính ở heo bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí di truyền và ứng dụng, Số 4 .
4. Tang, K. F. J., Lightner D. V, 2000. Quantification of white spot syndrome virus ADN throught a competitive polymerase chain reaction. Aquaculture, 189 : 11-21
5. Phát hiện nhanh Salmonella spp. trong thực phẩm ( Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên và tập sự. Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh )
6. Áp dụng kỹ thuật PCR sản xuất Bộ KIT chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm, bệnh vàng lá gân xanh. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ .
= = = =

Người viết bài:

SV. Vũ Hoài Hương Giang
SV. Hoàng Quốc Cường
Hiệu đính : TS. DS. Ngô Thiện

=====

Source: https://laodongdongnai.vn
Category: Nghiên Cứu