ỨNG DỤNG ĐẶC ĐIỂM SINH BÀO TỬ CỦA BACILLUS.SP ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ XỬ LÝ NƯỚC VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ NTTS

GIỚI THIỆU

Bacillus thuộc trực khuẩn Gram dương, di động (2-3 × 0,7-0,8 µm), có khả năng sinh nội bào tử ở trung tâm (1,5-1,8 × 0,8 µm). Ở điều kiện 100oC, bào tử Bacillus có thể chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. Bacillus hình thành bào tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng như có thể tồn tại trong thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi như khan hiếm chất dinh dưỡng. Hầu hết các loài thuộc Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu khí, chúng được phân lập dễ dàng từ đất, nước hoặc không khí. Khi xử lý mẫu bằng nhiệt độ (50-80oC, trong 10-30 phút), các tế bào sinh dưỡng thường bị nhiệt độ phá hủy trong khi nhiều bào tử còn sống sót. Bacillus cũng có thể phản ứng với sự thiếu dinh dưỡng bằng cách di chuyển cơ thể từ các điều kiện nghèo dinh dưỡng đến nơi tốt hơn nhờ vào các lông roi hoặc tạo bào tử để tồn tại (Mirel et al., 2000).

Ứng dụng bào tử Bacillus trong điều kiện tự nhiên để nâng cao hiệu quả xử lý nước

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh, khi môi trường sống bị thay đổi đột ngột hoặc do thiếu thức ăn, các loài vi khuẩn, trong đó có Bacillus tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động gọi là nội bào tử, có thể tránh bất kỳ sự tấn công nào có thể phá hủy thành tế bào. Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nẩy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi. Đó là loại tế bào ở trạng thái nghỉ khi quá trình sống bị ức chế mạnh. Cách đây 145 năm, bào tử ở vi khuẩn lần đầu tiên được phát hiện bởi Cohn và Koch vào năm 1876. Sau đó Koch cũng là người đầu tiên nghiên cứu về bào tử ở vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn gây bệnh than), cho thấy chúng có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà khoa học nghiên cứu về bào tử ở những loài khác với mục đích khám phá ra loại tế bào ngưng hoạt động này, đặc biệt bào tử có thể chịu được nhiệt độ cao và các điều kiện gây sốc khác. Kết quả nghiên cứu cho thấy bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử. Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh. Thời gian để hoàn thành quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn cần khoảng 8 giờ (có tài liệu viết 30-40 phút). Trong quá trình này, nhiễm sắc thể nhân đôi thành các bản sao riêng biệt. Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiễm sắc thể nằm trong bào tử, các phần còn lại bị tiêu hủy và bào tử được phóng thích. Nguyễn Lân Dũng (1983) cho rằng phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử và không phải tế bào nào cũng tạo được bào tử do vậy tỉ lệ sinh bào tử sẽ thấp hơn 100%. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm và mỗi bào tử chỉ cho ra một tế bào sinh dưỡng (tế bào bình thường). Trong tất cả các loài vi khuẩn, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kỳ điều kiện nào. Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào trong môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên có sự thống nhất là sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh và trong suốt pha tĩnh. Trong môi trường nước tự nhiên, số lượng vi khuẩn không tạo bào tử chiếm ưu thế (gần 87%) trong khi trong bùn vi khuẩn tạo bào tử chiếm ưu thế (gần 75%).

Trong ao nuôi thủy sản, khi môi trường thiếu thức ăn và xuất hiện mầm bệnh thì sự hình thành và nảy mầm bào tử ở vi sinh vật sẽ xảy ra, đây là một dạng tồn tại ở trạng thái không hoạt động. Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) cho thấy mật độ Bacillus luôn dao động khoảng 103-105 CFU/g (trong bùn đáy ao nuôi tôm công nghiệp) vào thời điểm trước, sau cải tạo ao và trong quá trình nuôi). Lý do là các hóa chất sử dụng trong quy trình cải tạo ao có thể giết được Bacillus ở dạng sinh dưỡng nhưng không thể giết chết được bào tử Bacillus. Nghiên cứu cho thấy trong quá trình cải tạo ao hầu hết các vi khuẩn gây bệnh (nhóm r-strategist = vi sinh vật dị dưỡng phát triển nhanh và cần nhiều chất hữu cơ cho quá trình sinh trưởng) sẽ chết sau khi phát triển quá mức với lượng thức ăn dồi giàu trong lớp đáy ao, do vậy sau cải tạo ao nhóm vi khuẩn gây bệnh sẽ bị loại ra khỏi môi trường, quá trình này gọi là quá trình khoáng hóa hay vô cơ hóa do nhóm vi khuẩn dị dưỡng đảm nhận. Trong khi đó các loài vi khuẩn sinh bào tử (Bacillus, Clostridium…) sẽ chuyển sang dạng bào tử và tồn tại trong đáy ao cho đến khi cấp nước mới và thức ăn được cung cấp vào. Bacillus trong lớp bùn đáy ao sẽ được nước di chuyển vào trong cột nước ao (qua sục khí) và phân hủy chất hữu cơ trong nước đồng thời phân hủy chất hữu cơ trong bùn. Bacillus sống trong bùn nhiều hơn trong nước do chất hữu cơ thường lắng tụ đáy ao (là nguồn thức ăn phong phú) sẽ làm tăng mật độ Bacillus.

Ứng dụng đặc điểm sinh bào tử ở vi khuẩn Bacillus subtilis

Trong tự nhiên vi khuẩn bào tử B. subtilis có thể được hình thành trong môi trường hạn chế về chất dinh dưỡng. Cơ chế hình thành của quá trình tạo bào tử thường bao gồm 7 giai đoạn như sau. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bảo tử. Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới.

Khi ở dạng bào tử Bacillus subtilis có thể không hoạt động trong một thời gian dài và giữ được khả năng chống chịu đáng kể đối với tác hại của môi trường bên ngoài như nhiệt độ, bức xạ, hóa chất độc hại và độ pH khắc nghiệt (như pH dạ dày: 1-3). Đặc điểm này của bào tử B. subtilis đã được ứng dụng nhiều trong y học, sản suất men tiêu hóa (cho người) với thành phần là bào tử B. subtilis. Khi người có hệ tiêu hóa kém có thể bổ sung bào tử B. subtilis, bào tử có thể tồn tại được trong dạ dày sau đó xuống ruột và nảy mầm ngay tại đầu ruột non, do vậy chúng sẽ tồn tại trong hệ đường ruột. Bào tử có thể ở trạng thái không hoạt động và kháng thuốc trong nhiều năm, nhưng khi tiếp xúc với các chất dinh dưỡng đầy đủ, bào tử có thể sống lại sau vài phút nảy mầm. Sự nảy mầm thường được kích hoạt bởi sự hiện diện của các chất dinh dưỡng, bao gồm axit amin, đường và nucleoside. Errington (1993) đã nghiên cứu đặc điểm của B. subtilis sau đó nhiều nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu như Stragier và Losick (1996), Sonnenshein (2000), Ablett et al., 1999; Atrih và Foster, (2002); Gould, (2006); Leuschner và Lillford, 2003 (trích dẫn bởi Cho et al., 2020).

*Chú thích (Hình 4):

a) Hình ảnh minh họa quá trình hình thành và nảy mầm của bào tử Bacillus subtilis. Nhiều lớp bào tử bảo vệ bộ gen, nằm trong lõi trung tâm bị mất nước một phần. Màng trong của nội bào tử (màu xám) có thể nhìn thấy được bằng kính hiển vi điện tử, nhưng màng ngoài của bào tử thường không nhìn thấy được. Lõi được bảo vệ bởi lớp vỏ (màu xanh lá cây) và lớp áo bào tử, bao gồm 4 lớp: lớp nền (màu xanh), lớp áo trong (màu cam), lớp áo ngoài (màu tím) và lớp vỏ (màu đỏ), chỉ nhìn thấy sau nhuộm đỏ ruthenium. Các vòng đồng tâm của lớp nền và lớp bên trong phản ánh hình phiến của lớp bên trong ảnh. Người ta vẫn chưa biết các phiến này hình thành như thế nào hoặc liệu chúng có được cấu tạo từ các protein cụ thể hay không.

b) Ảnh mặt cắt một bào tử B. subtilis nhuộm đỏ ruthenium qua kính hiển vi điện tử.

c) Ảnh mặt cắt của bào tử Bacillus anthracis được nhuộm bằng osmium tetroxide qua kính hiển vi điện tử. Vỏ ngoài là lớp bảo vệ ngoài cùng của bào tử và nó chứa các hình chiếu giống như sợi tóc. Nó được ngăn cách với phần còn lại của bào tử bởi một khoảng trống lớn.

Ưu và nhược điểm của bào tử ở vi khuẩn trong đời sống

Trong thực phẩm

Nhiều nghiên cứu cho thấy cấu tạo vỏ của bào tử bao gồm các lớp phủ protein dày, peptidoglycan, hàm lượng nước thấp, hàm lượng DPA cao và chứa các cation hóa trị hai trong lõi bào tử. Để diệt bào tử, sự kết hợp giữa xử lý vật lý và hóa học như sưởi ấm, UHP (áp suất cực cao), PEF (điện trường), UV (cực tím), IPL (ánh sáng cường độ cao) và các chất kháng khuẩn tự nhiên có thể tiêu diệt các bào tử trong thực phẩm. Gần đây, sự chú ý được tập trung vào các phương pháp bất hoạt không nhiệt dựa trên áp suất cao, siêu âm, điện trường cao áp và plasmas lạnh để khử bào tử liên quan đến suy giảm chất lượng và an toàn thực phẩm. Trong công nghệ thực phẩm, bào tử Bacillus (Bacillus cereus) có nguồn gốc từ đất có thể có trong sữa đậu nành và việc xử lý sữa đậu nành ở nhiệt độ cao trong thời gian dài thông thường có khả năng bất hoạt bào tử này. Tuy nhiên, các quá trình gia nhiệt liên quan đến tiệt trùng (UHT) ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng hương vị, màu sắc và kết cấu do biến tính protein và phân hủy các chất dinh dưỡng do nhiệt độ cao 121–135oC (rất nhiều thông tin trên về vấn đề này trên internet). Cơ chế đề kháng của bào tử đối với nhiệt ướt vẫn chưa được biết rõ, nhưng có thể là đa thành phần, chẳng hạn như nguyên sinh chất bào tử chứa lượng nước thấp. Ngoài ra, sự khoáng hóa của bào tử góp phần vào khả năng chịu nhiệt cũng như canxi, DPA. Trái ngược với sự thiếu hiểu biết về cơ chế của khả năng chịu nhiệt ướt, các protein hòa tan trong axit liên kết DNA là nguyên nhân chính gây ra khả năng chịu nhiệt khô. Hiện nay chất lượng sữa đóng hộp đã được bác sĩ và các nhà dinh dưỡng học khuyên người tiêu dùng nên thận trọng tìm hiểu kỹ, đây là sự thật mà ngành công nghiệp sữa đã che lấp. Thực chất thì sữa tươi rất tốt nếu xử lý diệt khuẩn trước khi uống ở nhiệt độ đủ diệt khuẩn thì hàm lượng protein và enzyme trong sữa không bị mất đi nhưng quy trình tiệt trùng ở nhiệt độ cao thì có thể diệt được bào tử nhưng lại ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm có thể nói đây là điểm bất lợi cho ngành thực phẩm.

Trong đời sống hàng ngày đã có trường hợp xảy ra khi ăn cơm nguội không hâm nóng đã làm cho con người có thể nhiễm bào tử Bacillus cereus gây bệnh ói mửa và tiêu chảy. Lý do quá trình nấu cơm bào tử không chết đi, khi nấu thành cơm là nguồn thức ăn tinh bột dồi giàu, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển trở lại trong cơm nguội làm cơm bị ôi thiêu, nếu không hâm nóng khi ăn vào có thể bị ói mửa và tiêu chảy. Tương tự như vậy 1 sinh viên người Bỉ đã chết vì kiệt sức do mất nước vì ói mửa khi ăn mì Ý để trong phòng 5 ngày.

Trong y học

Như chúng ta đã biết vi khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) là 1 trong gần vài trăm loài của giống Bacillus đã được sử dụng làm vũ khí sinh học trong chiến tranh. Ngược lại Bacillus subtilis là loài vi khuẩn hữu ích và được ứng dụng nhiều trong y học, nông nghiệp, thủy sản vì những giá trị tích cực mang lại trong vai trò tăng và ổn định hệ vi khuẩn đường ruột cho con người và tiết enzyme tiêu hóa, kháng sinh. Vi khuẩn Lactobacillus mặc dù không sinh bào tử nhưng có thể sống được trong môi trường pH thấp, nên đã được khuyên dùng để bổ sung vào hệ đường ruột thông qua uống men vi sinh và ăn yaout hàng ngày. Tuy nhiên hiện nay trong y khoa có nhiều tranh cãi về việc sử dụng 2 loại này. Mọi người có thể tìm hiểu qua internet để biết thêm thông tin.

Trong sản xuất chế phẩm vi sinh thủy sản

Để có thể có được những gói chế phẩm vi sinh bán trên thị trường và đến tay người nuôi đã phải trải qua một quá trình lâu dài với 6 bước bắt buộc:

Tại khoa Thủy sản, ĐHCT, chúng tôi một số loài Bacillus đã qua sàng lọc và thử nghiệm ở dạng lỏng và bột. Tuy nhiên chưa có nhiều kinh nghiệm nên các sản phẩm của chúng tôi (phục vụ nghiên cứu) có mật độ còn chưa ổn định (dao động 107-109CFU/ml). Dạng lỏng thường chúng tôi duy trì sản phẩm dạng tế bào sinh dưỡng chứ không phải bào tử. Chúng tôi đã theo dõi mật độ trong vòng 6 tháng sau thành phẩm. Còn dạng bột chúng tôi đã thử nghiệm làm thành phẩm là bào tử. Sinh khối tế bào Bacillus sau khi được ly tâm, trộn với chất phụ gia bột đậu nành và glucose (tỷ lệ 1:1) và sấy ở 51°C trong  3 – 5 giờ với, nghiền thành bột, kiểm tra chất lượng (dao động 107-109CFU/gam). Một số sản phẩm trên thị trường khi chúng tôi kiểm tra mật độ Bacillus đạt được 1010 (tỉ lệ này ít) trong khi phần lớn các sản phẩm thấp hơn.

Kết luận

Phần lớn chế phẩm vi sinh có mặt trên thị trường dành cho đối tượng nuôi thủy sản là Bacillus (vì hiệu quả vượt trội về mọi mặt), nếu chúng ta hiểu rõ về đặc điểm sinh bào tử của Bacillus sẽ giúp nâng cao hiểu biết về phương pháp bảo quản, sử dụng và duy trì trong ao nuôi. Mọi người lưu ý trong các giống vi khuẩn hữu ích đang ứng dụng hiện nay những giống loài sinh bào tử như Bacillus, xạ khuẩn Streptomyces…và những giống loài không sinh bào tử như Lactobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter…Bà con có thể tìm hiểu thêm thông tin trên mạng internet để nâng cao kiến thức nhằm quản lý tốt ao nuôi của mình để đạt kết quả như mong muốn.

Nguồn: PGS.TS. Phạm Thị Tuyết Ngân – Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ 

CĐKH – CÔNG TY TNHH VIBO