Ứng dụng hệ thống kính hiển vi ánh sáng phân cực (Polscope) trong đánh giá và chọn lọc noãn trưởng thành in Vitro
ThS. Võ Như Thanh Trúc – Chuyên viên phôi học – IVFAS
Hình trên cho ta thấy sự khác biệt rõ ràng giữa hình ảnh của noãn trưởng thành quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng phân cực (hình A) và hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi quang học thường (hình B). Ở cả hai hình, ta vẫn có thể quan sát được các thành phần chính cấu tạo nên noãn như zona pellucida (ZP), thể cực thứ nhất (khoanh tròn màu đỏ trong hình), khoảng PVS (perivitelline space) và noãn, nhưng với hệ thống kính hiển vi ánh sáng phân cực, ta có thể thấy được spindle và cấu trúc 3 lớp của ZP (IL – inner layer; ML – middle layer; OL – outer layer). Dưới kính hiển vi quang học thường, ta không thể quan sát được các cấu trúc này.
3.1 Các tiêu chí đánh giá spindle trong phân tích sự trưởng thành noãn
Bảng 1. So sánh các chỉ tiêu đánh giá spindle giữa nhóm bệnh nhân có thai lâm sàng và không có thai lâm sàng [12]
a. Độ lưỡng chiết của spindle (retardance)
Như đã phân tích ở trên, bộ phận polarizer trong hệ thống kính PolScope sẽ phân tích chùm sáng chưa phân cực thành hai chùm sáng khác nhau gồm chùm tia thường và chùm tia dị thường, hai tia này có vận tốc truyền sáng khác nhau. Thông số retardance được đo đạc bằng phần mềm tích hợp với hệ thống PolScope bằng cách chọn hai điểm ở vị trí tiếp giáp với hai cực của spindle, phần mềm sẽ tính toán khoảng cách chênh lệch giữa các chùm tia này khi ánh sáng truyền qua spindle theo phương vuông góc với spindle, tính bằng đơn vị nanomet. Các giá trị retardance sẽ được đo dọc theo chiều dài của spindle và tính giá trị trung bình cho ra thông số retardance cuối cùng, thể hiện độ lưỡng chiết của spindle [12].
Hình 4. Cách phần mềm tính toán thông số retardance của spindle
b. Hình dạng spindle
Dựa trên những hiểu biết về cơ chế phân tử của sự hình thành spindle, hệ thống spindle được hoàn thiện đúng cấu trúc sẽ có dạng hình trụ với các NST tập trung thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo. Nếu xuất hiện những bất thường trong việc tập hợp NST hoặc các NST không xếp thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo của spindle, cấu trúc spindle sẽ bị biến đổi. Một số nghiên cứu sử dụng kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi tiêu điểm cho thấy khi các NST không sắp xếp thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo của spindle sẽ làm thay đổi cấu trúc spindle [2], [3].
c. Chiều dài spindle
Chiều dài spindle được tính toán bằng phần mềm, là khoảng cách giữa điểm đầu tiên có tính lưỡng chiết ở một cực spindle đến điểm cuối cùng có tính lưỡng chiết ở cực còn lại của spindle, tính bằng micromet. Mối liên hệ giữa chiều dài spindle với khả năng thụ tinh, khả năng hình thành phôi tốt vẫn đang được nghiên cứu. So sánh tiêu chí này ở hai nhóm bệnh nhân có thai lâm sàng và không có thai lâm sàng chưa cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê [12].
d. Góc giữa spindle và thể cực
Góc giữa spindle và thể cực của noãn được đo bằng phần mềm, bằng cách dùng holding pipette giữ noãn sao cho thể cực ở hướng 12 giờ hoặc 6 giờ, dùng tâm của noãn làm gốc; đường nối giữa tâm noãn và thể cực là cạnh thứ nhất của góc, đoạn nối giữa tâm noãn và spindle là cạnh thứ hai. Góc giữa hai cạnh này là góc cần đo. Nghiên cứu của Rienzi và cộng sự (2003) cho thấy độ lớn góc lệch giữa spindle và thể cực liên quan đến khả năng thụ tinh bình thường (2PN) và khả năng hình thành phôi tốt, trong đó, những noãn có góc lệch này lớn hơn 90o có khả năng thụ tinh bình thường và tỉ lệ hình thành phôi tốt thấp hơn so với nhóm có độ lớn góc lệch nhỏ hơn [5].
4. Các bất thường spindle quan sát dưới hệ thống PolScope
Khi quan sát noãn dưới hệ thống PolScope, người ta quan sát một số bất thường hình thái spindle như xuất hiện thể cực nhưng không có spindle, hình dạng spindle không phải dạng hình trụ (hình 4.5).
Hình 5. Một số bất thường hình thái spindle quan sát dưới hệ thống PolScope
(A – noãn bình thường với sự xuất hiện của thể cực và spindle
B – noãn có xuất hiện thể cực nhưng không có hệ thống spindle
C – noãn bất thường vì chỉ một phần hệ thống spindle có dạng hình trụ
D – noãn bất thường do spindle không có dạng hình trụ)
5. Mối liên hệ giữa hình ảnh phân tích spindle và sự trưởng thành noãn
Theo nghiên cứu của Montag (2011), hình thái spindle phản ánh chính xác các giai đoạn trưởng thành nhân noãn. Hình 4.6 thể hiện hình ảnh quan sát spindle của noãn từ giai đoạn bắt đầu phóng thích thể cực thứ nhất đến khi spindle tan biến. Ở hình 4.6.A noãn đang ở metaphase I, khi spindle tiến sát rìa noãn và bắt đầu cảm ứng đánh dấu vị trí sau này sẽ phóng thích thể cực. Hình 4.6.B, C cho thấy màng noãn bắt đầu hình thành khe lõm (4.6.B) và hai khe lõm hợp nhau hình thành eo thắt, spindle nằm ở cả trong tế bào chất của noãn và phần chồi nhú, chuẩn bị hình thành thể cực (4.6.C); lúc này, noãn đang ở giai đoạn anaphase I. Từ hình 4.6.D đến 4.6.G, noãn đang ở telophase I sớm, khi sự phân chia tế bào chất bất đối xứng hoàn tất. Hình 4.6.H và 4.6.I cho thấy có hiện tượng tan spindle ở telophase I muộn. Dựa vào hình ảnh quan sát được, đối chiếu với hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, chúng ta đã có thể trả lời câu hỏi đặt ra về mối liên hệ giữa đánh giá noãn trưởng thành dựa vào hình thái và trạng thái trưởng thành thực sự của noãn. Từ hình 4.6.C trở đi, thường chúng ta sẽ đánh giá đó là các noãn trưởng thành MII do có sự xuất hiện của thể cực. Nhưng thực chất các noãn này chỉ mới đạt đến anaphase I hoặc telophase I. Ngoài ra, các hình ảnh này còn cung cấp thông tin cho những noãn được đánh giá bất thường không có spindle khi quan sát dưới PolScope, có thể là do noãn chỉ mới đạt đến cuối telophase I, hệ thống spindle tan biến nên ta không thể quan sát được.
Hình 6. Ảnh chụp spindle dưới hệ thống PolScope từ lúc bắt đầu phóng thích thể cực thứ nhất đến lúc spindle biến mất [7]
6. Kết luận
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cory Pelletier B.A., D.L.K., et al., Noninvasive polarized light microscopy quantitatively distinguishes the multilaminar structure of the zona pellucida of living human eggs and embryos. Fertility and Sterility, 2004. 81: p. 850 – 856.
2. D Christopikou, C.K., S Doriza, et al., Spindle and chromosome configurations of human oocytes matured in vitro in two different culture media. Reproductive BioMedicine Online, 2010. 20: p. 639 – 648.
3. Giovanni Coticchio, R.S., Karla Hutt, et al., Comparative analysis of the metaphase II spindle of human oocytes through polarized light and high-performance confocal microscopy. Techniques and Instrumentation, 2010. 93(6): p. 2056 – 2064.
4. Janos Konc, K.K., Sandor Cseh, Visualization and examination of the meiotic spindle in human oocytes with PolScope. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2004. 21(10): p. 349 – 353.
5. L.Rienzi, F.U., F.Martinez, et al., Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproductive, 2003. 18(6): p. 1289 – 1293.
6. Laura Rienzi, F.U., Marcello Iacobelli, et al., Meiotic spindle visualization in living human oocytes. Reproductive BioMedicine Online, 2004. 10(2): p. 192 – 198.
7. Markus Montag, M.K., et al., Gamete competence assessment by polaring optics in assisted reproduction. Human Reproductive Update, 2011. 17(5): p. 654 – 666.
8. Nikon. Introduction to Polarized Light Microscopy. Available from:
9. Robert M., F.U., et al., Oocyte denuding. Practical Manual of In Vitro Fertilization: Advanced Methods and Novel Devices, 2012: p. 93 – 104.
10. Rodriguez, A., et al., Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res, 2004. 14(10A): p. 1902-10.
11. S.Cooke, J.P.P.T., G.L.Driscoll, Meiotic spindle location and identification and its effect on embryonic cleavage plane and early development. Human Reproduction, 2003. 18(11): p. 2397 – 2405.
12. Suha Kilani, S.C., Andrew Kan, et al., Are there non-invasive markers in human oocytes that can predict pregnancy outcome? Reproductive BioMedicine Online, 2009. 18(5): p. 674 – 680.
Hệ thống kính hiển vi ánh sáng phân cực là một hệ thống kết hợp với hệ thống vi thao tác giúp chúng ta đánh giá đúng và chọn lọc những noãn thực sự trưởng thành về nhân để thực hiện ICSI, cũng như cho chúng ta thêm những thông tin quý giá để tiên lượng kết cục ICSI ở các noãn mang các bất thường trong cấu trúc spindle mà quan sát trên hệ thống kính vi thao tác bình thường không thể phát hiện được. Ứng dụng PolScope có thể giúp chúng ta dễ dàng tiên lượng cũng như cải thiện hơn kết cục ICSI của bệnh nhân.1. Cory Pelletier B.A., D.L.K., et al., Noninvasive polarized light microscopy quantitatively distinguishes the multilaminar structure of the zona pellucida of living human eggs and embryos. Fertility and Sterility, 2004.: p. 850 – 856.2. D Christopikou, C.K., S Doriza, et al., Spindle and chromosome configurations of human oocytes matured in vitro in two different culture media. Reproductive BioMedicine Online, 2010.: p. 639 – 648.3. Giovanni Coticchio, R.S., Karla Hutt, et al., Comparative analysis of the metaphase II spindle of human oocytes through polarized light and high-performance confocal microscopy. Techniques and Instrumentation, 2010.(6): p. 2056 – 2064.4. Janos Konc, K.K., Sandor Cseh, Visualization and examination of the meiotic spindle in human oocytes with PolScope. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2004.(10): p. 349 – 353.5. L.Rienzi, F.U., F.Martinez, et al., Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproductive, 2003.(6): p. 1289 – 1293.6. Laura Rienzi, F.U., Marcello Iacobelli, et al., Meiotic spindle visualization in living human oocytes. Reproductive BioMedicine Online, 2004.(2): p. 192 – 198.7. Markus Montag, M.K., et al., Gamete competence assessment by polaring optics in assisted reproduction. Human Reproductive Update, 2011.(5): p. 654 – 666.8. Nikon. Introduction to Polarized Light Microscopy. Available from: https://www.microscopyu.com/articles/polarized/polarizedintro.html 9. Robert M., F.U., et al., Oocyte denuding. Practical Manual of In Vitro Fertilization: Advanced Methods and Novel Devices, 2012: p. 93 – 104.10. Rodriguez, A., et al., Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res, 2004.(10A): p. 1902-10.11. S.Cooke, J.P.P.T., G.L.Driscoll, Meiotic spindle location and identification and its effect on embryonic cleavage plane and early development. Human Reproduction, 2003.(11): p. 2397 – 2405.12. Suha Kilani, S.C., Andrew Kan, et al., Are there non-invasive markers in human oocytes that can predict pregnancy outcome? Reproductive BioMedicine Online, 2009.(5): p. 674 – 680.
