Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan in vitro của các dịch chiết từ cây phèn đen ( Phyllanthus reticulates Poir.)

Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Công Thùy Trâm, Đỗ Thị Phương, Vũ Thị Thu Phương, Nguyễn Thị Nga, Gilles Truan, Đỗ Thị Thảo

Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 251-258, 2017

Trong y học cổ truyền Việt Nam, cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) là một vị thuốc quý và thường được sử dụng để thanh nhiệt, giải độc, sát trùng, lợi tiểu, tiêu viêm… Với thành công trong việc tách enzyme CPR (6,1 mg) từ dịch nhân nuôi (8,7 ml) chủng Saccharomyces cerevisiae WR1A2 (5 lít/mẻ), chúng tôi đã sử dụng CPR này trong thử nghiệm sàng lọc nhanh hoạt tính bảo vệ gan ở mức in vitro và cho thấy kết quả khá tương đồng với kết quả thu được từ thí nghiệm chống oxy hóa (phép thử DPPH và MDA). Theo đó, dịch chiết nước của cây Phèn đen đã thể hiện hoạt tính cảm ứng CPR nhằm giải độc cho cơ thể và bảo vệ gan. Đồng thời dịch chiết nước, dịch chiết EtOAc, dịch chiết tổng cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất tốt thông qua việc trung hòa gốc tự do của DPPH và ức chế quá trình peroxy hóa lipid với SC50 tương ứng là 13,84 µg/ml, 37,64 µg/ml, 28,31 µg/ml và IC50 tương ứng là5,99 µg/ml, 4,77 µg/ml, 27,58 µg/ml.

MỞ ĐẦU

Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể con người và động vật với vai trò quan trọng trong chuyển hóa độc tố, thuốc… Sự chuyển hóa thuốc, các độc tố ở gan cần có sự tham gia của hệ thống các cytochrome P450. Một trong số các cytochrome P450 này là NADPH cytochrome P450 reductase (CPR), một diflavoprotein enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc của cơ thể (Porter, Kasper, 1986). Đã có báo cáo cho thấy việc bất hoạt hoạt động của CPR bằng kháng thể đơn dòng dẫn tới sự dừng hoạt động hoàn toàn của CYP3A (Yamazaki et al., 1999; 2002). Như vậy, việc cảm ứng hoạt động CPR được xem là khởi đầu cho quá trình chuyển hóa các độc tố, các thuốc điều trị để bảo vệ gan của chính các tế bào gan, cũng như của cơ thể.

Các thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan đa phần được thực hiện ở mức in vivo như trên mô hình chuột bị gây độc cấp cho gan bởi CCl4, acetaminophen… Những thử nghiệm này thường có chi phí cao, mất nhiều thời gian và hiệu suất thử nghiệm thấp (một vài chất/1 thí nghiệm). Vì vậy, việc thiết lập thử nghiệm bảo vệ gan ở mức in vitro trên tế bào hay sử dụng enzyme được xem là lựa chọn thay thế hiệu quả, bởi hiệu suất cao (hàng trăm hợp chất/1 thí nghiệm) và thời gian ngắn.Vì thế, hệ enzyme cytochrome P450, cụ thể là CPR được coi là đích nghiên cứu quan trọng trong các thử nghiệm bảo vệ gan. Ronneau và đồng tác giả (1992) đã thành công trong việc biểu hiện nhiều isozyme cytochrome P450 như cytochrome P450 reductase (CPR) trong tế bào nấm men, cơ sở quan trọng cho việc thực hiện phép thử sinh học nhờ kích hoạt hệ enzyme CPR để giải độc cho cơ thể, nhằm tìm kiếm hoạt chất có hoạt tính bảo vệ gan in vitro.

Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) thuộc chi Phyllanthus, là một loại cây bụi mọc nhiều nơi trên thế giới như ở Ấn Độ, Bangladesh, Trung Quốc …. Ở nước ta, cây Phèn đen mọc hoang ở ven đường, ven bờ khắp cả nước. Cây Phèn đen được sử dụng phổ biến để làm thuốc chữa kiết lỵ, tiêu chảy, thanh nhiệt giải độc…Thành phần hóa học của Phèn đen gồm: tannic acid, friedelin, epifriedelinol, betulin, taraxerone, beta-sitosterol, glochidonol, octacosanol, taraxeryl acetate flavonoid, triterpenoid, courmarin, quercetin… (Sharma, Kumar, 2013). Một số nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng dịch chiết của cây Phèn đen có tác dụng chống oxyyhóa (Aswatha et al., 2008; Maruthappan, Shree, 2010; Yeasmin et al., 2015), chống dung nạp đường huyết cũng như hạ đường huyết (Kumar et al., 2008, Khatun et al., 2014), có hoạt tính kháng viêm (Saha et al., 2008; Khatun et al., 2013), giảm đau (Rahmatullah et al., 2010; Khatun et al., 2013), bảo vệ gan (Bhawna,
Kumar, 2009), chống virus viêm gan B (Das et al., 2011). Kumar và đồng tác giả (2012) cũng chứng minh quả của cây Phèn đen có hoạt tính kháng viêm.

Tuy nhiên, ở nước ta cây Phèn đen lại chưa được nghiên cứu nhiều về các hoạt tính sinh học này. Vì vậy, trong báo cáo dưới đây, chúng tôi đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của cây Phèn đen nhằm tìm kiếm hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan.

Hình ảnh cây Phèn đen

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

• Cây Phèn đen được thu hái vào mùa hè ở ngoại thành Hà Nội và được phân loại bởi TS. Trần Phương Anh, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học.
• Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae WR1A2 đã được chuyển gen biểu biện enzyme CPR, do Trung tâm Nghiên cứu sinh học hệ thống và Ứng dụng (INSA, Toulouse), Cộng hòa Pháp cung cấp.
• Chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, 6- 8 tuần tuổi, không phân biệt giống, khối lượng 26 ± 2 g, được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết mẫu thực vật

• Lá và thân cây Phèn đen được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (mỗi loại có khối lượng là 3 kg).
• Nguyên liệu bột mịn được chiết với ethanol 96 độ (3 lần) bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp và thu nhận cao tổng số.
• Dịch chiết n-Hexane, dịch chiết CH2Cl2,dịch chiết EtOAc và dịch chiết nước được chuẩn bị bằng cách bổ sung nước và chiết phân lớp lần lượt với dung môi n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate.

Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết thông qua ức chế peroxy hóa lipid (MDA)

Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Phèn đen thông qua ức chế peroxy hóa lipid được thực hiện theo phương pháp của Ngô Quốc Hận và Nguyễn Thị Thu Hương (2011), Badmus và đồng tác giả (2011), cụ thể:

• Tách não chuột, nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (tỉ lệ 1:10) ở nhiệt độ 0-4oC.
• Lấy 1 ml dịch đồng thể não; thêm 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ; 0,8 ml đệm phosphate; 0,1 ml hệ Fenton (FeSO4 0.1 mM : H2O2 15 mM, tỉ lệ 1:1).
• Ủ ở37oC trong 15 phút.
• Thêm 1 ml TCA10%.
• Ly tâm 12000 vòng trong 5 phút.
• Lấy dịch trong cho phản ứng với Thiobarbituric acid (TBA)(Sigma Aldrich) 0,8% (tỉ lệ 2:1). Ủ ở 100oC trong 15 phút.
• Làm lạnh và đo ở bước sóng λ = 532 nm.
• Trolox được sử dụng làm chất đối chiếu tham khảo.

Hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) thông qua khả năng ức chế peroxy hóa lipid (MDA) được tính như sau: HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] × 100

Với:

• ODC : Mật độ quang học của giếng đối chứng không có mẫu thử;
• ODT : Mật độ quang học của mẫu thử.

Giá trị IC50 (Inhibition Concentration at 50% – nồng độ ức chế được 50% peroxy hóa lipid) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm TableCurve 2Dv4.

Xác định đặc tính chống oxy hóa của dịch chiết thông qua khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH

Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Phèn đen thông qua khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH được tiến hành theo phương pháp của Yuvaraj và đồng tác giả (2013) có chỉnh sửa.

• Trước hết DPPH (2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl) (Sigma Aldrich) được pha trong methanol (100%) ở nồng độ 0,25 µM.
• Hút 1 ml các dịch chiết phân đoạn của Phèn đen và ascorbic acid (đối chứng tham khảo) đã pha ở các nồng độ vào các ống thủy tinh.
• Thêm 1 ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu.
• Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
• Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đọc ELISA.
• Giếng có dung môi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được xem là giếng đối chứng. Giếng có sử dụng ascorbic acid (Vitamin C) là chất đối chứng tham khảo.

Khả năng trung hòa gốc tự do (Scavenging Activities – SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử tính theo công thức:

% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử) × 100/ODđối chứng (%)

Với

• ODđối chứng là độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử
• ODmẫu thử là độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử.

Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% – nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm TableCurve 2Dv4.

Thu nhận enzyme CPR từ dịch lên men chủng Saccharomyces cerevisiae WR1A2

• Chủng nấm men S. cerevisiae WR1A2 sau khi hoạt hóa được nhân nuôi ở bình 5 lít.
• Toàn bộ nấm nem từ dịch nuôi cấy được thu nhân bằng cách ly tâm ở tốc độ 5000 g trong 10 phút, cặn tế bào sau đó được rửa bằng nước cất vô trùng và ly tâm một lần nữa.
• Tế bào được phá vỡ bằng cách hòa tan cặn trong đệm TES bổ sung hạt bead thủy tivà và lắc mạnh cho tới khi tế bào vỡ hết.
• Thêm 25 ml đệm TES vào hỗn hợp tế bào-hạt bead, ly tâm hỗn dịch ở 10000 g trong 10 phút ở 4oC.
• Sau khi thu dịch nổi, bổ sung thêm PEG4000 vào dung dịch, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 4oC trong120 phút sau đó ly tâm ở 10000 g, 30 phút, 4oC để thu cặn.
• Hòa tan cặn bằng 1 ml đệm TEG. Dùng kim và mũi tiêm uốn cong để hút và đẩy dịch enzyme trong 1 phút. Cho vào các ống Eppendorf và cất giữ ở -80oC cho những thí nghiệm tiếp theo.

Xác định hàm lượng protein Sử dụng bộ Pierce BCA Protein Assay Kit của Thermo Scientific

Dựng đường chuẩn BSA ở các nồng độ 1 mg; 0,5 mg; 0,25 mg; 0,125 mg và 0 mg; Pha loãng mẫu từ 2 – 10 lần; Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất kit; Đọc kết quả ở máy ELISA plate reader (Biotek) với bước sóng 562 nm.

Xác định hoạt tính enzyme CPR

Pha 10 µl dịch enzyme thu được ở trên với 1590 µl đệm Tris-HCl (Tris-HCL 10 mM + EDTA 2 mM); Cho dithionite vừa đủ để khử CPR, chia vào 2 cuvette, phun khí CO thật từ từ vào cuvette chứa mẫu khoảng 3 giây.Tính toán hoạt độ của CPR ở bước sóng 450 nm/480 nm sử dụng phương trình Beer’s Law là A= ε× c × L (ε = 90 mM/cm; c là nồng độ heme; L= 1).

Thử nghiệm hoạt tính cảm ứng enzyme CPR

Phương pháp được thực hiện theo Yim và đồng tác giả (2005), có sự điều chỉnh. Cụ thể là: 20 µM MTT, 4 pmol CPR cùng với hệ NADPH (0,1 mM NADP+, 1 mM glucose 6-phosphate, và 0,1 unit glucose 6-phosphate dehydrogenase/ml), 10 µl dịch chiết các phân đoạn của cây Phèn đen, tổng thể tích của 1 phản ứng cho mỗi giếng là 200 µl (đĩa 96 giếng). Đo mật độ quang học của phản ứng ở bước sóng 610 nm bằng máy ELISA plate reader (Biotek) tại các thời điểm.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Với 3 kg mẫu bao gồm lá và thân cây Phèn đen qua quá trình chiết qua các dung môi chúng tôi đã thu được 78 g dịch chiết tổng; 19 g dịch chiết n Hexane, 17 g dịch chiết CH2Cl2, 10 g EtOAc và 23 g dịch chiết nước.

Các phân đoạn thu được từ cây Phèn đen ở trên được xác định khả năng chống oxy hóa và cảm ứng CPR nhằm tìm hiểu khả năng bảo vệ gan của loài thực vật này.

Hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid của các phân đoạn từ cây Phèn đen

Khả năng ức chế peroxy hoá lipid của Phèn đen được thực hiện thông qua xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), sản phẩm của quá trình peroxy hoá các phân tử lipid trên màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm. Kết quả về xác định hoạt tính chống oxy hóa thông qua ức chế peroxy hóa lipid (MDA) của các dịch chiết từ cây Phèn đen được trình bày ở bảng 1.

• Kết quả bảng 1 cho thấy

  dịch chiết tổng, dịch chiết nước, dịch chiết EtOAc đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh

  thông qua ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào với IC50 tương ứng là 5,99 và 4,77 µg/ml.

• Với mức hoạt tính này, dịch chiết nước và dịch chiết EtOAc đã thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt và mạnh so với đối chứng Trolox (IC50 = 10,96 µg/ml). Dịch chiết tổng cho thấy mức hoạt tính khá tốt trong khi dịch chiết Hexan và CH2Cl2 thể hiện mức hoạt tính yếu ở các nồng độ nghiên cứu.

Hoạt chất từ cây Phèn đen có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan

Kết quả này cho thấy triển vọng trong việc tách chiết hoạt chất từ cây Phèn đen có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Aswatha và đồng tác giả (2008) về tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết nước và dịch chiết methanol của cây Phèn đen thông qua việc ức chế peroxy hóa lipid IC50 tương ứng là 41,91 µg/ml và 32,16 µg/ml.

Hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH của các dịch chiết từ cây Phèn đen 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH) là một gốc tự do, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt của chất chống oxy hóa, DPPH bị khử thành 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng.

Đo kết quả sau phản ứng ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa. Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Phèn đen thông qua phép thử trung hòa gốc tự do của DPPH được trình bày ở bảng 2.

• Kết quả bảng 2 cũng cho thấy dịch chiết tổng, dịch chiết nước, dịch chiết EtOAc đã thể hiện hoạt tính chống oxy hóa qua việc trung hòa gốc tự do của DPPH với SC50 tương ứng là 28,31 µg/ml, 13,84 µg/ml và 37,64 µg/ml.
• Dịch chiết Hexan và dịch chiết CH2Cl2 không thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu.

Như vậy, với các phép thử chống oxy hóa được thực hiện trong nghiên cứu này thì một số dịch chiết của cây Phèn đen đã thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất tốt là dịch chiết nước, dịch chiết EtOAc. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi là phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới như Aswatha và đồng tác giả (2008), Maruthappan và Shree (2010). Các tác giả này cũng đã ghi nhận khả năng chống oxy hóa của dịch chiết nước và dịch chiết methanol từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) với IC50 tương ứng là 20,36 µg/ml và14,31 µg/ml (phép thử DPPH).

Kết quả thử nghiệm hoạt tính cảm ứng enzyme CPR để bảo vệ gan của các dịch chiết

Thu nhận CPR tổng số Với phương pháp thu nhận CPR microsome như đã nêu ở phần phương pháp, chúng tôi đã thu được 8,7 ml dịch enzyme CPR. Hàm lượng protein của dịch enzyme được xác định nhờ sử dụng bộ Pierce BCA Protein Assay Kit của Thermo Scientific và dựng đường chuẩn liên kết giữa hàm lượng protein
BSA và giá trị OD. Sau khi có đường chuẩn BSA chúng tôi xác định được lượng microsome chứa CPR đạt 0,702 mg/ml. Như vậy, với 8,7 ml dịch enzyme CPR thu được ở trên cho tương ứng 6,1 mg CPR.

Sau khi thu nhận CPR, hoạt độ của CPR được xác định thông qua phương pháp định lượng bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 450/490 nm (hình 2) và tính toán theo phương trình Beer’s Law: C = A/(ε x L) (Trong đó: C là nồng độ heme (Mol/L); A (độ hấp thụ) = Ymax – Ymin; ε = 90 mM/cm; L= 1).

Kết quả trên cho thấy enzyme CPR thu được hoạt động tốt và ổn định với hoạt độ bằng 26,08IU. Như vậy, CPR thu được ở trên đã đáp ứng được các điều kiện để sử dụng trong các thử nghiệm sàng lọc nhanh nhằm đánh giá hoạt tính bảo vệ gan in vitro của các chất tiềm năng thông qua khả năng cảm ứng CPR.

Đánh giá khả năng cảm ứng CPR của các dịch chiết từ cây Phèn đen

Dựa vào phương pháp đánh giá khả năng cảm ứng CPR của Yim và đồng tác giả (2005) như đã được trình bày ở phần thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xác định khả năng cảm ứng CPR của các dịch chiết từ cây Phèn đen (hình 3).

Kết quả ở hình 3 cho thấy các dịch chiết từ cây Phèn đen tác động đến hoạt động của enzyme CPR theo các mức độ khác nhau và thể hiện hoạt tính tối đa ở các mốc thời gian khác nhau.

• Theo đó, dịch chiết nước thể hiện khả năng cảm ứng mạnh nhất và đạt mức tối đa ở mốc 270 phút.
• Dịch chiết EtOAc cho thấy hoạt tính cảm ứng CPR thấp, không thể hiện rõ đỉnh cực đại của phản ứng.
• Các dịch chiết còn lại cũng đã phần nào cho thấy khả năng cảm ứng hoạt động của hệ enzyme CPR.

Theo Yim và đồng tác giả (2005), CPR là một enzyme oxy hóa khử với chức năng chuyển điện tử từ NADPH đến các chất nhận bao gồm các enzyme cytochrome P450, cytochrome b5 và cytochrome c, đồng thời enzyme này cũng xúc tác cho các phản ứng khử điện tử của nhiều loại thuốc.

Trong mô hình gây độc gan trên chuột bằng CCl4, hoạt tính của các enzyme chuyển hóa thuốc như cytochrome P450, cytochrome b5 reductase, CPR giảm và được cải thiện khi được bảo vệ bằng các hoạt chất chống oxy hóa như acid galic hay vitamin E (Kujawska et al., 2007; Sheweita et al., 2001),

Như vậy, lần đầu tiên các dịch chiết từ cây Phèn đen đã được nghiên cứu khả năng cảm ứng enzyme CPR để bảo vệ gan ở mức in vitro và cho thấy những kết quả khả quan, khá tương đồng với kết quả thu được từ thí nghiệm chống oxy hóa (phép CO spectra 26.08µM thử DPPH và MDA). Kết quả này là tiền đề cho việc sử dụng CPR tái tổ hợp trong các thử nghiệm sàng lọc nhanh, hiệu suất cao, tiết kiệm chi phí để tìm các hoạt chất tiềm năng có khả năng bảo vệ gan ở mức in vitro, trước khi đưa lên kiểm chứng trên mô hình động vật.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu đã tách chiết thành công enzyme CPR từ chủng nấm men S. cerevisiae WR1A2 và đã thu được 8,7 ml dịch enzyme CPR chứa 6,1 mg CPR, đạt 0,702 mg/ml, hoạt độ 26,08 IU. CPR tái tổ hợp được đưa vào sử dụng trong thử nghiệm sàng lọc nhanh các hoạt chất/dịch chiết tiềm năng có khả năng bảo vệ gan ở mức in vitro, trước khi đưa lên kiểm chứng trên mô hình động vật.

Với nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã chứng minh được hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các dịch chiết từ cây Phèn đen thu hái tại Hà Nội thông qua việc trung hòa gốc tự do của DPPH, ức chế quá trình peroxy hóa lipid và khả năng cảm ứng hệ enzyme NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) của gan.

Lời cảm ơn: Chúng tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về KHCN cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam năm 2015-2016, thuộc chương trình hợp tác với CNRS, Cộng hòa Pháp.