Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms) bằng kĩ – Tài liệu text
Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms) bằng kĩ thuật IN vitro
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.42 MB, 57 trang )
Bạn đang đọc: Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms) bằng kĩ – Tài liệu text
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
– – – –
TRẦN THỊ THẮM
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms)
BẰNG KĨ THUẬT IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
HÀ NỘI, 2014
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
– – – –
TRẦN THỊ THẮM
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms)
BẰNG KĨ THUẬT IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Người hường dẫn khoa học
Th.S LA VIỆT HỒNG
HÀ NỘI, 2014
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh
KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân
Phong – Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ đã
giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng
xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên
cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật,
Phòng thí nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi
về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội,10 tháng 04 năm 2014
Sinh viên
TRẦN THỊ THẮM
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội,10 tháng 04 năm 2014
Sinh viên
TRẦN THỊ THẮM
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN ii
MỤC LỤC Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu Error! Bookmark not defined.
3. Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined.
4. Ý nghĩa của đề tài 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa (L.) Harms 3
1.1.1. Phân loại 3
1.1.2. Mô tả 3
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố 3
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L). Harms
4
1.1.4.1.Trong lá 4
1.1.4.2. Trong rễ 4
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng 4
1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro 5
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5
1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 6
1.2.2.1. Ưu điểm 6
1.2.2.2. Nhược điểm 7
1.2.3. Các giai đoạn nhân giống in vitro 8
iv
1.2.3.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô cấy 8
1.2.3.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy 8
1.2.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi 8
1.2.3.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh 9
1.2.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất 9
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 9
1.2.4.1. Mô nuôi cấy 9
1.2.4.2. Vô trùng trong nuôi cấy 10
1.2.4.3. Điều kiện nuôi cấy 11
1.2.4.4. Môi trường nuôi cấy 13
1.2.4.5. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy 13
1.2.4.6. Ảnh hưởng của pH và Agar 15
1.3. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng 16
1.3.1. Tạo cây con 16
1.3.2. Tạo phôi soma 16
1.3.3. Tạo sẹo và phát sinh phôi soma 16
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 18
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 18
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 18
2.2.3. Môi trường nuôi cấy 20
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu 21
2.3.2. Bố trí thí nghiệm 22
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh Đinh lăng. 23
v
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo
đa chồi (Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi). 24
2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro (Ảnh hưởng của NAA
đến khả năng tạo rễ ở chồi đỉnh Đinh lăng) 24
2.3.2.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và
sinh lý của cây Đinh lăng in vitro 25
a. Thí nghiệm 4a: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu 25
b. Thí nghiệm 4b: Đánh giá một số đặc điểm sinh lý 26
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)
Harms) 28
3.2. Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo đa chồi (Ảnh hưởng của
BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng in vitro) 33
3.3. Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 35
3.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý
của cây Đinh lăng in vitro 37
3.4.1. Thí nghiệm 4a: Đánh giá đặc điểm hình thái, giải phẫu 37
3.4.2. Thí nghiệm 4b: Đánh giá một số đặc điểm sinh lý 39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
4.1. Kết luận 41
4.2. Kiến nghị 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC 46
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC
GIẢ 47
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng. 23
Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả 24
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của NAA đến tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 25
Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 29
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Đinh lăng 33
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ ở cây Đinh lăng 36
Bảng 3.4 Hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và tổng số (a+b) 39
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa (L.) Harms 3
Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 30
Hình 3.2 Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5
ngày nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy. 31
Hình 3.3 Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây
Đinh lăng 33
Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Đinh lăng 34
Hình 3.5 Chồi Đinh lăng sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BAP 35
Hình 3.6 Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 37
Hình 3.7. Hình thái chồi ngọn cây Đinh lăng 38
Hình 3.8 (A) Lát cắt ngang chồi đỉnh Đinh lăng tự nhiên, (B) Cắt ngang chồi
đỉnh Đinh lăng in vitro. 38
Hình 3.9 (A) Lát cắt ngang cuống lá Đinh lăng tự nhiên; (B)Lát cắt ngang cuống
lá Đinh lăng in vitro 39
Hình a: Thao tác trong box cấy vô trùng 45
Hình b: Kiểm tra mẫu nuôi cấy trong phòng cây tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên
cứu Khoa học & Chuyển giao Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.45
viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NAA: Napthlacetic acid
BA: Benzyl adenin
IBA: Indol butyric acid
2,4 – D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic aicd
BAP: 6-Benzyl amino purin
MS: Murashige và Skoog
Nxb: Nhà xuất bản
Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộc họ Nhân sâm hay
Ngũ gia bì (Araliaceae) [1], là cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học dân
gian Việt Nam và Trung Quốc. Theo nhiều nghiên cứu, cây Đinh lăng có nhiều
tác dụng dược lí giống Nhân sâm, đặc biệt dược liệu từ cây Đinh lăng có tác
dụng tăng cường thể lực, tăng sức đề kháng và tăng khả năng thích nghi [2].
Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy, trong Đinh lăng có chứa
alkaloid, saponin, acid amin, vitamin và trong Nhân sâm, Tam thất thì
saponin được coi là một trong những thành phần hóa học có tác dụng chính của
dược liệu. Đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi có hàm lượng saponin cao nhất
và cũng thể hiện các tác dụng dược lý mạnh hơn so với các bộ phận khác (lá,
thân) [3], [4], [23].
Đinh lăng thể hiện nhiều ưu điểm như dễ trồng, dễ sử dụng, nhưng việc sử
dụng dược liệu hiện nay còn hạn chế do chưa được chú ý trồng trọt, khai thác,
bào chế. Mặt khác, Đinh lăng có nhiều loại khác nhau như: Đinh lăng lá nhỏ
(Polyscias fruticosa (L.) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana),
Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei) [1]. Sự khác biệt về điều kiện dinh dưỡng
và địa lí có thể làm thay đổi hình thái và chất lượng của Đinh lăng.
Để góp phần việc đẩy mạnh việc sử dụng có hiệu quả nguồn dược liệu
trong nước, khai thác vốn quý của y học dân tộc, cụ thể là đối với cây Đinh lăng
nói riêng và các cây trong họ Nhân sâm nói chung. Một hướng nghiên cứu mới
đã và đang được quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo
nguồn giống đồng nhất, năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với
trồng ngoài tự nhiên.
Việc tạo ra cây Đinh lăng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để
phục vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm
2
từ Đinh lăng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân
giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng kĩ thuật in vitro.”
2. Mục đích nghiên cứu
Nhân giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harm) bằng phương
pháp tạo đa chồi trong điều kiện in vitro.
3. Nội dung nghiên cứu
– Quy trình tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa
(L.) Harms).
– Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở Đinh lăng (Polyscias
fruticosa (L.) Harms) trong nhân giống in vitro.
– Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ của cây Đinh lăng (Polyscias
fruticosa (L.) Harms) trong nhân giống in vitro.
– Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý chồi đỉnh cây
Đinh lăng in vitro.
4. Ý nghĩa của đề tài
– Ý nghĩa lí luận: Nhằm góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in
vitro về cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms).
– Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể được sử dụng nghiên cứu
trong nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu. Góp phần sản xuất cây giống có
hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao
hiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa (L.) Harms
1.1.1. Phân loại
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp: Magnolyopsida (Ngọc lan)
Bộ: Araliales (Nhân sâm)
Họ: Araliaceae (Nhân sâm hay Ngũ gia bì)
Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dương
lâm, ) [1].
1.1.2. Mô tả
Cây Đinh lăng – Polyscias
fruticosa (L.) Harms là cây bụi cao
0,5 – 2 m. Thân tròn sần sùi, không có
gai. Rễ phù như củ. Lá kép mọc cách,
có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2 – 3 lần,
dài 20 – 40 cm. Lá chét có cuống gầy
dài 3 -10 mm, phiến lá chét có răng
cưa không đều, chóp nhọn các đoạn
đều có cuống, lá có mùi thơm. Cuống
lá dài, tròn, màu xanh sậm, đáy cuống
phình to thành bẹ lá. Cụm hoa hình
thùy ngắn 7 – 18 mm ở ngọn, gồm
nhiều tán mang nhiều hoa nhỏ, màu
trắng xám. Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt. Quả hình trứng, dẹt,
dài 3 -4 mm, màu trắng bạc [1].
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dương. Cây phân bố ở
Malayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, hiện có hơn
Hình 1.1: Cây Đinh lăng –
Polyscias fruticosa (L.) Harms [25]
4
10 loài Đinh lăng [1], được trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm thuốc ở
quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng được sử dụng làm thuốc phổ
biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài có nhiều tác dụng dược
lý giống Nhân sâm [2].
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L). Harms
Cây Đinh lăng chứa alkaloid, glycosid và các vitamin tan trong nước như:
B
1
, B
2
, B
6
và các phytosterin. Vỏ và lá Đinh lăng chứa saponin [3].
1.1.4.1.Trong lá
Lá Đinh lăng chứa sapoin triterpen chiếm 1,65%, sapoin triterpen trong lá
là một genin dạng acid olenolic, đây là một hợp chất thứ cấp có tác dụng dược
liệu.
Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 5
hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng là: Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca –
1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3ol- 10on
và Heptadeca – 1,8 (Z)- dien-4,6 diyn- 3ol- 10on [3].
1.1.4.2. Trong rễ
Trong rễ Đinh lăng có glycosid, alkaloid, vitamin (B
1
, B
2
, B
6
, C), các
phytosterin và 20 acid amin, trong đó có các acid amin không thể thay thế
(lysin, methionin, trytophan, cystein) [4]. Và trong rễ Đinh lăng mới chỉ thấy 5
hợp chất polyacetylen trong đó có Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 (E)-
dien-4,6 diyn- 3,10 diol là 3 hợp chất giống trong lá. Các hợp chất này có tác
dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư [3].
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng
Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự đã tìm được từ cây
Đinh lăng những tính chất của Nhân sâm: Rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng
cường sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống hiện tượng mệt mỏi, giúp
ăn ngủ ngon, tăng khả năng lao động, lên cân và chống độc. Ngoài ra, theo Y
học cổ truyền, Hải Thượng Lãn Ông đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng, sắc cho
5
phụ nữ uống sau khi đẻ để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết sữa. Đinh
lăng còn được dùng chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ. Phối hợp với sữa ong chúa
là thuốc bổ rất tốt [23].
1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học
thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902),
nhà thực vật học người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng
thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [5]. Thực tế đã chứng
minh được khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào
riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại
bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành
cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [20].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả
của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó:
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.
Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và
phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào ngược lại với sự
phân hóa tế bào.
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một số gen khác lại
bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa
6
trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ
thể thực vật luôn được hài hòa.
Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật
điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong
điều kiện nhân tạo và vô trùng). Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở
đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kĩ thuật tiên tiến cho việc
chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [6], [7].
1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
1.2.2.1. Ưu điểm
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những ưu
điểm chính:
– Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát
triển và đạt năng suất cao.
– Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã
chọn lọc.
– Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao.
– Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội).
– Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen.
– Có khả năng sản xuất quanh năm.
– Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh
thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.
– Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản
xuất đại trà [8].
Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp
không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ:
Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 5
32
trong vòng một năm đối với
cây khoai tây bằng phương pháp này [9]. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất
7
10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống
mới rất khó khăn [5]. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể
cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [21].
1.2.2.2. Nhược điểm
Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết
bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao
hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác [22]. Ngoài ra, phương pháp này
còn có những nhược điểm sau:
– Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây non có
kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau
ống nghiệm.
– Cây có thể có những đặc tính không mong muốn.
– Khả năng tạo đột biến tăng.
– Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tế
bào nhiều lần.
– Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi
để phục vụ những mục đích sau:
– Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác
chọn giống.
– Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các
loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây
cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo.
– Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp
và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ.
– Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm
sạch virus.
8
– Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài
giao phấn trong ngân hàng gen.
1.2.3. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Sự thành công của việc nhân giống in vitro đạt được khi trải qua các giai
đoạn sau [7]:
1.2.3.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu thực
vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên.
Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau
vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.
1.2.3.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy
Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi
hoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tùy từng đối tượng mà người ta còn có thể
dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa, Mục đích của giai
đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này
được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin ngoại sinh
đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý của
mẫu cấy. Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy của cây được lấy vào thời
kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
1.2.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo
ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn then
chốt của quá trình.
Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin),
các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch thủy phân
9
Casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào
từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình
thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm
cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
1.2.3.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ
này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, các chất IAA, IBA, α-
NAA và 2,4-D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất.
1.2.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra
đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định
khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ, để
tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Để đảm bảo cho cây có tỷ lệ
sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ
10 – 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó chuyển
cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường [7].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
1.2.4.1. Mô nuôi cấy
Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô
phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt
vào môi trường có chứa một lượng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô
sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân
hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau.
Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi
cấy. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò
10
quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu
được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển
ở một giai đoạn nhất định [12]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu
nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các
chồi bên và mô phân sinh đỉnh.
1.2.4.2. Vô trùng trong nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và
vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế
bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi
trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một
tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí
nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết
dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng
trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành
công. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta
phải thực hiện các yêu cầu sau:
– Vô trùng mô cấy.
– Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy.
– Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt
môi trường nuôi cấy.
Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc
với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm.
Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có
hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc
vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô
cấy [13].
Street (1974), đưa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất
diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [13]:
11
Tác nhân vô
trùng
Nồng độ (%)
Thời gian xử
lý (phút)
Hiệu quả
Hypochlorite canxi
9 – 10
5 – 30
Rất tốt
Hypochlorite natri
2
5 – 30
Rất tốt
Hydroperoxid
(H
2
O
2
)
10 – 12
5-15
Tốt
Nước Brom
1 – 2
2-10
Rất tốt
HgCl
2
0,1 – 1
2-10
Trung bình
Chất kháng sinh
4 – 50 mg/l
30-60
Khá tốt
Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt
nấm, khuẩn, với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch
bằng xà phòng và nước máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều
lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vô
trùng trước khi đặt mô cấy lên môi trường nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của
tác nhân vô trùng lên mô cấy [13].
1.2.4.3. Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ:
Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro
qua các tiến trình sinh lý như hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ
thích hợp nhất thường được dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 27
o
C [13].
Có nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm
cho chức năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm. Hầu hết, những thí
nghiệm nuôi cấy mô thực vật được thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế
nhiệt độ. Những người trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trì
khả năng sinh trưởng khi yêu cầu nhiệt cho cây non còn thấp. Nuôi cấy ở ngăn
lạnh làm giảm sinh trưởng và làm giảm giá thành cần thiết do cấy truyền.
12
Ánh sáng:
Ảnh hưởng của ánh sáng có thể được chia ra trong sự tác động của cường
độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ)
và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của thực vật. Cường độ ánh
sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy
in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường độ ánh sáng điển hình cho vi
nhân giống là từ 40 – 80 μmol/m
2
/giây trong nuôi cấy vươn thân, nhưng cường
độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều.
Kiểu nút đậy kín có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy,
các loài cây khác nhau thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh
sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200
μmol/m
2
/giây).
Chất lượng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và
kiểu bình cấy được sử dụng. Thông thường trong các phòng nuôi cấy mô sử
dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ. Chất lượng ánh sáng cũng
làm thay đổi phản ứng sinh trưởng của chồi in vitro. Người ta cho rằng chất
lượng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và có thể bị kích
thích bởi xử lý ánh sáng xanh trước khi di chuyển cây từ nuôi cấy. Chất lượng
ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triển chồi, là nguyên nhân
làm các yếu tố môi trường phát triển trong nuôi cấy thay đổi (Hartmann và ctv,
1997).
Không khí:
Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao
gồm oxy, carbon dioxide và ethylene. Các nhà trồng cây thương mại không nỗ
lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và
nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khác
nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng thông qua lỗ thông khí bị đóng kín
hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997).
13
1.2.4.4. Môi trường nuôi cấy
Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính
sau đây:
– Các muối khoáng đa luợng
– Các muối khoáng vi lượng
– Các Vitamin
– Đường làm nguồn cacbon
– Các chất điều hòa sinh trưởng
Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần
xác định như acid amin, EDTA, hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết
nấm men…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi
cấy. Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây
khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trường:
– Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Knop.
– Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5, Gamborg.
– Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Murashige – Skoog).
1.2.4.5. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh
học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá
trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh
trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật. Nó đóng vai
trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý,
hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện
của môi trường [15].
14
Auxin:
Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch
dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của
ống phấn [15].
Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phân
hoá, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tượng hướng động, ưu thế
ngọn, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả….
Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu. Sự kéo dài của tế bào
rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxin
giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ
quá cao.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo
giai đoạn phát triển của chúng. Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều
chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm.
Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của
chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm
soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA. Trong
lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai
tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình
thành rễ [13].
Cytokinin:
Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự
hiện diện của auxin. Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh
tổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành
chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ [11].
Sự sinh trưởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất
khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân
hay rễ). Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ.
15
Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ
phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác
động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với auxin [13]. Trong nuôi cấy mô,
cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn
trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng
tế bào trong con đường phân hoá [13].
Gibberellin:
Hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài
lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì. Kích
thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc
tính nổi bật của gibberellin. Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin)
kích thích mạnh sự tăng trưởng lá [15].
Ảnh hưởng của than hoạt tính:
Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có những tác
dụng sau:
– Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không
màu khác.
– Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin,
chelate Fe và Zn…).
– Thúc đẩy sự tạo phôi soma.
– Ổn định độ pH.
1.2.4.6. Ảnh hưởng của pH và Agar
pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi
cấy mô. Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát
triển của mô [10], [14].
Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết
môi trường dinh dưỡng. Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả
năng làm đông môi trường. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước
TRẦN THỊ THẮMNGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂYĐINH LĂNG ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ) BẰNG KĨ THUẬT IN VITROKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCChuyên ngành : Sinh lý học thực vậtNgười hường dẫn khoa họcTh. S LA VIỆT HỒNGHÀ NỘI, 2014L ỜI CẢM ƠNTôi xin bày tỏ lòng biết ơn thâm thúy tới Th.s La Việt Hồng – Khoa SinhKTNN Trường Đại học Sư phạm TP. Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp sức tôitrong suốt quy trình thực thi đề tài. Tôi xin cảm ơn tới những Ban Giám hiệu trường ĐHSP Thành Phố Hà Nội 2, Ban Chủnhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP TP. Hà Nội đã tạo mọi điều kiện kèm theo để tôihoàn thành khóa luận này. Trong thời hạn triển khai đề tài tôi cũng nhận được sự giúp sức tận tìnhcủa cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong XuânPhong – Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ đãgiúp đỡ, góp phần quan điểm để tôi triển khai xong đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũngxin gửi lời cảm ơn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiêncứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật – trường ĐHSP Thành Phố Hà Nội 2 đã tạo điều kiện kèm theo thuận lợivề thiết bị, phương tiện đi lại để tôi hoàn toàn có thể triển khai xong khóa luận này. Cảm ơn mái ấm gia đình và bè bạn đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quatrình học tập và triển khai xong đề tài. TP.HN, 10 tháng 04 năm 2014S inh viênTRẦN THỊ THẮMiiLỜI CAM ĐOANTôi xin cam kết ràng buộc đây là khu công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, tác dụng nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố. TP. Hà Nội, 10 tháng 04 năm 2014S inh viênTRẦN THỊ THẮMiiiMỤC LỤCLỜI CẢM ƠN iLỜI CAM ĐOAN iiMỤC LỤC Error ! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC BẢNG viDANH MỤC CÁC HÌNH viiDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viiiMỞ ĐẦU 11. Lý do chọn đề tài 12. Mục đích nghiên cứu Error ! Bookmark not defined. 3. Nội dung nghiên cứu Error ! Bookmark not defined. 4. Ý nghĩa của đề tài 2CH ƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 31.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa ( L. ) Harms 31.1.1. Phân loại 31.1.2. Mô tả 31.1.3. Nguồn gốc, phân bổ 31.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa ( L ). Harms1. 1.4.1. Trong lá 41.1.4. 2. Trong rễ 41.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng 41.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro 51.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 51.2.2. Ưu, điểm yếu kém của phương pháp nhân giống in vitro 61.2.2. 1. Ưu điểm 61.2.2. 2. Nhược điểm 71.2.3. Các quá trình nhân giống in vitro 8 iv1. 2.3.1. Giai đoạn 1 : Khử trùng mô cấy 81.2.3. 2. Giai đoạn 2 : Tái sinh mô nuôi cấy 81.2.3. 3. Giai đoạn 3 : Nhân nhanh chồi 81.2.3. 4. Giai đoạn 4 : Tạo cây hoàn hảo 91.2.3. 5. Giai đoạn 5 : Đưa cây ra đất 91.2.4. Các yếu tố tác động ảnh hưởng đến quy trình nuôi cấy mô 91.2.4. 1. Mô nuôi cấy 91.2.4. 2. Vô trùng trong nuôi cấy 101.2.4.3. Điều kiện nuôi cấy 111.2.4.4. Môi trường nuôi cấy 131.2.4.5. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy 131.2.4.6. Ảnh hưởng của pH và Agar 151.3. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng 161.3.1. Tạo cây con 161.3.2. Tạo phôi soma 161.3.3. Tạo sẹo và phát sinh phôi soma 16CH ƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 182.1. Thời gian và khu vực nghiên cứu 182.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 182.2.1. Đối tượng nghiên cứu 182.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 182.2.3. Môi trường nuôi cấy 202.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro 212.3. Phương pháp nghiên cứu 212.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu 212.3.2. Bố trí thí nghiệm 222.3.2.1. Thí nghiệm 1 : Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh Đinh lăng. 232.3.2.2. Thí nghiệm 2 : Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng chiêu thức tạođa chồi ( Ảnh hưởng của BAP đến năng lực tạo đa chồi ). 242.3.2.3. Thí nghiệm 3 : Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro ( Ảnh hưởng của NAAđến năng lực tạo rễ ở chồi đỉnh Đinh lăng ) 242.3.2.4. Thí nghiệm 4 : Đánh giá một số ít đặc thù hình thái, giải phẫu vàsinh lý của cây Đinh lăng in vitro 25 a. Thí nghiệm 4 a : Đánh giá 1 số ít đặc thù hình thái, giải phẫu 25 b. Thí nghiệm 4 b : Đánh giá 1 số ít đặc thù sinh lý 262.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 27CH ƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 283.1. Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ) 283.2. Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng giải pháp tạo đa chồi ( Ảnh hưởng củaBAP đến năng lực tạo đa chồi cây Đinh lăng in vitro ) 333.3. Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 353.4. Thí nghiệm 4 : Đánh giá 1 số ít đặc thù hình thái, giải phẫu và sinh lýcủa cây Đinh lăng in vitro 373.4.1. Thí nghiệm 4 a : Đánh giá đặc thù hình thái, giải phẫu 373.4.2. Thí nghiệm 4 b : Đánh giá một số ít đặc thù sinh lý 39CH ƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 414.1. Kết luận 414.2. Kiến nghị 41T ÀI LIỆU THAM KHẢO 43PH Ụ LỤC 46C ÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁCGIẢ 47 viDANH MỤC CÁC BẢNGBảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác lập hiệu suất cao của chất khử trùng. 23B ảng 2.2. Công thức thí nghiệm xác lập tác động ảnh hưởng của BAP đến khả 24B ảng 2.3 : Ảnh hưởng của NAA đến tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 25B ảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 29B ảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến thông số nhân chồi cây Đinh lăng 33B ảng 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ ở cây Đinh lăng 36B ảng 3.4 Hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và tổng số ( a + b ) 39 viiDANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1 Cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa ( L. ) Harms 3H ình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 30H ình 3.2 Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng. ( Trái ) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, ( Phải ) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy. 31H ình 3.3 Các bước đơn thuần tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của câyĐinh lăng 33H ình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến thông số nhân chồi cây Đinh lăng 34H ình 3.5 Chồi Đinh lăng sau 8 tuần nuôi cấy trên thiên nhiên và môi trường có bổ trợ BAP 35H ình 3.6 Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 37H ình 3.7. Hình thái chồi ngọn cây Đinh lăng 38H ình 3.8 ( A ) Lát cắt ngang chồi đỉnh Đinh lăng tự nhiên, ( B ) Cắt ngang chồiđỉnh Đinh lăng in vitro. 38H ình 3.9 ( A ) Lát cắt ngang cuống lá Đinh lăng tự nhiên ; ( B ) Lát cắt ngang cuốnglá Đinh lăng in vitro 39H ình a : Thao tác trong box cấy vô trùng 45H ình b : Kiểm tra mẫu nuôi cấy trong phòng cây tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiêncứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm TP.HN 2.45 viiiDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTNAA : Napthlacetic acidBA : Benzyl adeninIBA : Indol butyric acid2, 4 – D : 2,4 – Dichlorophenoxy acetic aicdBAP : 6 – Benzyl amino purinMS : Murashige và SkoogNxb : Nhà xuất bảnTp. HCM : Thành phố Hồ Chí MinhMỞ ĐẦU1. Lý do chọn đề tàiCây Đinh lăng – Polyscias fruticosa ( L. ) Harms thuộc họ Nhân sâm hayNgũ gia bì ( Araliaceae ) [ 1 ], là cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học dângian Nước Ta và Trung Quốc. Theo nhiều nghiên cứu, cây Đinh lăng có nhiềutác dụng dược lí giống Nhân sâm, đặc biệt dược liệu từ cây Đinh lăng có tácdụng tăng cường thể lực, tăng sức đề kháng và tăng năng lực thích nghi [ 2 ]. Các hiệu quả nghiên cứu trước đây cho thấy, trong Đinh lăng có chứaalkaloid, saponin, acid amin, vitamin và trong Nhân sâm, Tam thất thìsaponin được coi là một trong những thành phần hóa học có công dụng chính củadược liệu. Đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi có hàm lượng saponin cao nhấtvà cũng biểu lộ những tính năng dược lý mạnh hơn so với những bộ phận khác ( lá, thân ) [ 3 ], [ 4 ], [ 23 ]. Đinh lăng biểu lộ nhiều ưu điểm như dễ trồng, dễ sử dụng, nhưng việc sửdụng dược liệu lúc bấy giờ còn hạn chế do chưa được quan tâm trồng trọt, khai thác, bào chế. Mặt khác, Đinh lăng có nhiều loại khác nhau như : Đinh lăng lá nhỏ ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ), Đinh lăng lá tròn ( Polyscias balfouriana ), Đinh lăng trổ ( Polyscias guilfoylei ) [ 1 ]. Sự độc lạ về điều kiện kèm theo dinh dưỡngvà địa lí hoàn toàn có thể làm biến hóa hình thái và chất lượng của Đinh lăng. Để góp phần việc tăng cường việc sử dụng có hiệu suất cao nguồn dược liệutrong nước, khai thác vốn quý của y học dân tộc bản địa, đơn cử là so với cây Đinh lăngnói riêng và những cây trong họ Nhân sâm nói chung. Một hướng nghiên cứu mớiđã và đang được chăm sóc đó là vận dụng công nghệ sinh học thực vật để tạonguồn giống như nhau, hiệu suất cao, thời hạn thu hoạch ngắn hơn so vớitrồng ngoài tự nhiên. Việc tạo ra cây Đinh lăng không thay đổi và như nhau là yếu tố thiết yếu đểphục vụ cho nhu yếu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, bào chế những sản phẩmtừ Đinh lăng. Vì vậy, chúng tôi thực thi nghiên cứu đề tài : “ Nghiên cứu nhângiống cây Đinh lăng ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ) bằng kĩ thuật in vitro. ” 2. Mục đích nghiên cứuNhân giống cây Đinh lăng ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harm ) bằng phươngpháp tạo đa chồi trong điều kiện kèm theo in vitro. 3. Nội dung nghiên cứu – Quy trình tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ). – Ảnh hưởng của BAP đến năng lực tạo đa chồi ở Đinh lăng ( Polysciasfruticosa ( L. ) Harms ) trong nhân giống in vitro. – Ảnh hưởng của α – NAA đến năng lực ra rễ của cây Đinh lăng ( Polysciasfruticosa ( L. ) Harms ) trong nhân giống in vitro. – Nghiên cứu 1 số ít đặc thù hình thái, giải phẫu và sinh lý chồi đỉnh câyĐinh lăng in vitro. 4. Ý nghĩa của đề tài – Ý nghĩa lí luận : Nhằm góp thêm phần bổ trợ vào nguồn tài liệu nghiên cứu invitro về cây Đinh lăng ( Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ). – Ý nghĩa thực tiễn : Kết quả của đề tài hoàn toàn có thể được sử dụng nghiên cứutrong nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu. Góp phần sản xuất cây giống cóhiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp thêm phần nâng caohiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế những loại sản phẩm từ Đinh lăng. CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU1. 1. Giới thiệu về cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa ( L. ) Harms1. 1.1. Phân loạiNgành : Magnoliophyta ( Ngọc lan ) Lớp : Magnolyopsida ( Ngọc lan ) Bộ : Araliales ( Nhân sâm ) Họ : Araliaceae ( Nhân sâm hay Ngũ gia bì ) Loài : Polyscias fruticosa ( L. ) Harms ( Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dươnglâm, ) [ 1 ]. 1.1.2. Mô tảCây Đinh lăng – Polysciasfruticosa ( L. ) Harms là cây bụi cao0, 5 – 2 m. Thân tròn sần sùi, không cógai. Rễ phù như củ. Lá kép mọc cách, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2 – 3 lần, dài 20 – 40 cm. Lá chét có cuống gầydài 3 – 10 mm, phiến lá chét có răngcưa không đều, chóp nhọn những đoạnđều có cuống, lá có mùi thơm. Cuốnglá dài, tròn, màu xanh sậm, đáy cuốngphình to thành bẹ lá. Cụm hoa hìnhthùy ngắn 7 – 18 mm ở ngọn, gồmnhiều tán mang nhiều hoa nhỏ, màutrắng xám. Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt. Quả hình trứng, dẹt, dài 3 – 4 mm, màu trắng bạc [ 1 ]. 1.1.3. Nguồn gốc, phân bốCây Đinh lăng có nguồn gốc từ những hòn đảo Thái Bình Dương. Cây phân bổ ởMalayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc Ở Nước Ta, hiện có hơnHình 1.1 : Cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa ( L. ) Harms [ 25 ] 10 loài Đinh lăng [ 1 ], được trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm thuốc ởquy mô nhỏ theo từng hộ mái ấm gia đình, loài Đinh lăng được sử dụng làm thuốc phổbiến nhất là Polyscias fruticosa ( L. ) Harms. Đây là loài có nhiều tính năng dượclý giống Nhân sâm [ 2 ]. 1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa ( L ). HarmsCây Đinh lăng chứa alkaloid, glycosid và những vitamin tan trong nước như :, B, Bvà những phytosterin. Vỏ và lá Đinh lăng chứa saponin [ 3 ]. 1.1.4. 1. Trong láLá Đinh lăng chứa sapoin triterpen chiếm 1,65 %, sapoin triterpen trong lálà một genin dạng acid olenolic, đây là một hợp chất thứ cấp có công dụng dượcliệu. Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 5 hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng là : Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 ( E ) – dien-4, 6 diyn – 3,10 diol, Heptadeca – 1,8 ( E ) – dien-4, 6 diyn – 3 ol – 10 onvà Heptadeca – 1,8 ( Z ) – dien-4, 6 diyn – 3 ol – 10 on [ 3 ]. 1.1.4. 2. Trong rễTrong rễ Đinh lăng có glycosid, alkaloid, vitamin ( B, B, B, C ), cácphytosterin và 20 acid amin, trong đó có những acid amin không hề sửa chữa thay thế ( lysin, methionin, trytophan, cystein ) [ 4 ]. Và trong rễ Đinh lăng mới chỉ thấy 5 hợp chất polyacetylen trong đó có Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 ( E ) – dien-4, 6 diyn – 3,10 diol là 3 hợp chất giống trong lá. Các hợp chất này có tácdụng kháng khuẩn mạnh và chống một số ít dạng ung thư [ 3 ]. 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăngQua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự chiến lược đã tìm được từ câyĐinh lăng những đặc thù của Nhân sâm : Rễ Đinh lăng có công dụng làm tăngcường sức dẻo dai và sức đề kháng của khung hình, chống hiện tượng kỳ lạ căng thẳng mệt mỏi, giúpăn ngủ ngon, tăng năng lực lao động, lên cân và chống độc. Ngoài ra, theo Yhọc truyền thống, Hải Thượng Lãn Ông đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng, sắc chophụ nữ uống sau khi đẻ để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết sữa. Đinhlăng còn được dùng chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ. Phối hợp với sữa ong chúalà thuốc bổ rất tốt [ 23 ]. 1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro1. 2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vậtCơ sở khoa học của chiêu thức nuôi cấy mô tế bào in vitro là họcthuyết về tính toàn năng ( totipotence ) của tế bào. Theo Haberlandt G. ( 1902 ), nhà thực vật học người Đức, tổng thể những tế bào của cây đều mang hàng loạt lượngthông tin di truyền của khung hình, khi gặp điều kiện kèm theo thích hợp, mỗi tế bào đều cókhả năng tái sinh và tăng trưởng thành thành viên hoàn hảo [ 5 ]. Thực tế đã chứngminh được năng lực tái sinh của một khung hình thực vật hoàn hảo từ một tế bàoriêng rẽ. Hàng trăm loài cây xanh đã được nhân giống trên quy mô thương mạibằng cách nuôi cấy trong môi trường tự nhiên tự tạo vô trùng và tái sinh chúng thànhcây với thông số nhân giống vô cùng lớn [ 20 ]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quảcủa quy trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó : Sự phân hóa tế bào là sự chuyển những tế bào phôi sinh thành những tế bào môchuyên hóa, tiếp đón những công dụng khác nhau. Khi những tế bào đã phân hóa thành những tế bào có tính năng riêng không liên quan gì đến nhau, chúng không trọn vẹn mất năng lực biến hóa của mình mà trong trường hợpcần thiết, ở điều kiện kèm theo thích hợp chúng hoàn toàn có thể trở về dạng tế bào phôi sinh vàphân chia can đảm và mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào ngược lại với sựphân hóa tế bào. Về thực chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quy trình hoạt hóa, ức chế những gen. Tại một thời gian nào đó trong quy trình tăng trưởng thành viên, cómột số gen được hoạt hóa để bộc lộ tính trạng mới, còn 1 số ít gen khác lạibị ức chế hoạt động giải trí. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóatrong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quy trình sinh trưởng của cơthể thực vật luôn được hài hòa. Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuậtđiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật ( khi nuôi cấy tách rời trongđiều kiện tự tạo và vô trùng ). Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sởđơn vị mô, tế bào, những nhà sinh vật học triển khai kĩ thuật tiên tiến và phát triển cho việcchọn, cải tổ và cả lai tạo giống cây xanh [ 6 ], [ 7 ]. 1.2.2. Ưu, điểm yếu kém của phương pháp nhân giống in vitro1. 2.2.1. Ưu điểmPhương pháp nhân giống in vitro có năng lực khắc phục được nhiều trởngại mà những chiêu thức nhân giống khác thường gặp, sau đây là những ưuđiểm chính : – Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì thế có tiềm năng sinh trưởng, pháttriển và đạt hiệu suất cao. – Tạo cây con giống hệt về mặt di truyền, bảo tồn được những tính trạng đãchọn lọc. – Tạo được dòng thuần của những cây tạp giao. – Tạo được cây có gen mới ( đa bội, đơn bội ). – Bảo quản và tàng trữ tập đoàn lớn gen. – Có năng lực sản xuất quanh năm. – Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện kèm theo sinhthái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. – Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời hạn đưa một giống mới vào sảnxuất đại trà phổ thông [ 8 ]. Về phương diện thông số nhân giống, nhân giống in vitro là phương phápkhông gì hoàn toàn có thể so sánh kịp, kể cả giải pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ : Mai Thị Tân và tập sự đã đạt được thông số nhân 532 trong vòng một năm đối vớicây khoai tây bằng chiêu thức này [ 9 ]. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giốngmới rất khó khăn vất vả [ 5 ]. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thểcung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [ 21 ]. 1.2.2. 2. Nhược điểmNhược điểm chính của giải pháp nuôi cấy in vitro là yên cầu trang thiếtbị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu suất cao so với những cây có giá trị caohoặc khó nhân giống bằng chiêu thức khác [ 22 ]. Ngoài ra, giải pháp nàycòn có những điểm yếu kém sau : – Mặc dù số lượng cây giống thu được hoàn toàn có thể rất cao nhưng cây non cókích thước nhỏ, yên cầu phải có chính sách chăm nom đặc biệt quan trọng ở quy trình tiến độ sauống nghiệm. – Cây hoàn toàn có thể có những đặc tính không mong ước. – Khả năng tạo đột biến tăng. – Khả năng tái sinh hoàn toàn có thể bị mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tếbào nhiều lần. – Cây giống hoàn toàn có thể bị nhiễm bệnh hàng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãiđể Giao hàng những mục tiêu sau : – Duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý và hiếm làm vật tư cho công tácchọn giống. – Nhân nhanh và duy trì những thành viên đầu dòng tốt để cung ứng hạt giống cácloại cây xanh khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, câycảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo. – Nhân nhanh và kinh tế tài chính những kiểu gen quý và hiếm của giống cây lâm nghiệpvà gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, hoa lá cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ. – Nhân nhanh ở điều kiện kèm theo vô trùng và cách ly tái nhiễm phối hợp với làmsạch virus. – Bảo quản và lưu giữ những tập đoàn lớn giống nhân giống vô tính và những loàigiao phấn trong ngân hàng nhà nước gen. 1.2.3. Các quy trình tiến độ nhân giống in vitroSự thành công xuất sắc của việc nhân giống in vitro đạt được khi trải qua những giaiđoạn sau [ 7 ] : 1.2.3. 1. Giai đoạn 1 : Khử trùng mô cấyĐây là quy trình tiến độ tối quan trọng, thậm chí còn quyết định hành động hàng loạt quy trìnhnhân giống in vitro. Mục đích của tiến trình này là tạo ra được nguyên vật liệu thựcvật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công xuất sắc ngay lần tiên phong. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời hạn vô trùng thích hợp thì sauvài lần thử chắc như đinh sẽ đạt tác dụng. 1.2.3. 2. Giai đoạn 2 : Tái sinh mô nuôi cấyTrong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồihoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tùy từng đối tượng người dùng mà người ta còn có thểdùng những mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa, Mục đích của giaiđoạn này là sự tái sinh một cách xu thế những mô nuôi cấy. Quá trình nàyđược tinh chỉnh và điều khiển hầu hết dựa vào tỉ lệ những hợp chất auxin, cytokinin ngoại sinhđưa vào môi trường tự nhiên nuôi cấy. Tuy nhiên, cần phải chăm sóc đến tuổi sinh lý củamẫu cấy. Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy của cây được lấy vào thờikỳ sinh trưởng mạnh cho tác dụng rất khả quan trong tái sinh chồi. 1.2.3. 3. Giai đoạn 3 : Nhân nhanh chồiToàn bộ quy trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích mục tiêu tạora thông số nhân cao nhất. Chính thế cho nên, tiến trình này được xem là quá trình thenchốt của quy trình. Để tăng thông số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường tự nhiên dinhdưỡng tự tạo những chất điều hòa sinh trưởng ( Auxin, Cytokinin, Gibberelin ), những chất bổ trợ khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch thủy phânCasein phối hợp với những yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vàotừng đối tượng người tiêu dùng nuôi cấy người ta hoàn toàn có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hìnhthành những cụm chồi ( nhân cụm chồi ), hay sự tăng trưởng của chồi nách ( vi giâmcành ) hoặc trải qua việc tạo cây từ phôi vô tính. 1.2.3. 4. Giai đoạn 4 : Tạo cây hoàn chỉnhKhi đạt size nhất định những chồi được chuyển từ môi trường tự nhiên ở giaiđoạn 3 sang môi trường tự nhiên tạo rễ. Thường sau từ 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻnày sẽ Open rễ và trở thành cây hoàn hảo. Ở tiến trình này, người tathường bổ trợ vào thiên nhiên và môi trường nuôi cấy những Auxin, những chất IAA, IBA, α-NAA và 2,4 – D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất. 1.2.3. 5. Giai đoạn 5 : Đưa cây ra đấtỞ quá trình này, đưa cây hoàn hảo ( có đủ thân, rễ, lá ) từ ống nghiệm rađất là bước sau cuối của quy trình nhân giống in vitro và là bước quyết địnhkhả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất. Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên mặt phẳng rễ, đểtránh sự xâm nhập của côn trùng nhỏ và nấm mốc. Để bảo vệ cho cây có tỷ lệsống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên những giá thể thích hợp từ10 – 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non khởi đầu hình thành. Sau đó chuyểncây ra đất với chính sách chăm nom thông thường [ 7 ]. 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng tác động đến quy trình nuôi cấy mô1. 2.4.1. Mô nuôi cấyTheo kim chỉ nan tổng thể những mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như : Môphân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang tăng trưởng, thịt quả non …, khi đặtvào thiên nhiên và môi trường có chứa một lượng hormon thích hợp đều có năng lực tạo môsẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có năng lực tạo mô sẹo, phânhóa thành rễ, thân, cành, lá … rất khác nhau. Do đó hiệu quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôicấy. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quy trình nuôi cấy có vai trò10quyết định, nếu chọn sai mẫu tất cả chúng ta sẽ không thu nhận được hiệu quả, hoặc thuđược những cây sẽ không tăng trưởng mạnh, thậm chí còn cây hoàn toàn có thể ngưng phát triểnở một quá trình nhất định [ 12 ]. Các hiệu quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầunghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến cácchồi bên và mô phân sinh đỉnh. 1.2.4. 2. Vô trùng trong nuôi cấyMôi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng vàvitamin, thích hợp cho những loài nấm, vi trùng tăng trưởng. Do vận tốc phân loại tếbào của nấm và vi trùng lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môitrường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi trùng thì sau vài ngày đến mộttuần hàng loạt mặt phẳng môi trường tự nhiên nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thínghiệm phải vô hiệu vì trong điều kiện kèm theo này mô cấy không hề tăng trưởng và chếtdần. Khác với thí nghiệm vi sinh hoàn toàn có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùngtrong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật yên cầu rất cao mới có hy vọng thànhcông. Để bảo vệ điều kiện kèm theo vô trùng trong quy trình nuôi cấy yên cầu chúng taphải triển khai những nhu yếu sau : – Vô trùng mô cấy. – Vô trùng dụng cụ thủy tinh, thiên nhiên và môi trường và nút đậy. – Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặtmôi trường nuôi cấy. Mô cấy hoàn toàn có thể là những bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúcvới môi trường tự nhiên bên ngoài mà những bộ phận này chứa nhiều hay ít vi trùng, nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy thông dụng lúc bấy giờ là dùng những chất hóa học cóhoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của những chất này phụ thuộcvào thời hạn giải quyết và xử lý, nồng độ và năng lực xâm nhập của chúng trên mặt phẳng môcấy [ 13 ]. Street ( 1974 ), đưa ra khái niệm về nồng độ và thời hạn sử dụng những chấtdiệt nấm khuẩn để giải quyết và xử lý mô cấy như sau [ 13 ] : 11T ác nhân vôtrùngNồng độ ( % ) Thời gian xửlý ( phút ) Hiệu quảHypochlorite canxi9 – 105 – 30R ất tốtHypochlorite natri5 – 30R ất tốtHydroperoxid ( H10 – 125 – 15T ốtNước Brom1 – 22-10 Rất tốtHgCl0, 1 – 12-10 Trung bìnhChất kháng sinh4 – 50 mg / l30-60Khá tốtTrong quy trình giải quyết và xử lý mô cấy phải ngập trọn vẹn trong dung dịch diệtnấm, khuẩn, với những bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi giải quyết và xử lý cần rửa sạchbằng xà phòng và nước máy. Sau khi giải quyết và xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiềulần bằng nước cất vô trùng ( tối thiểu 3 lần ), vô hiệu những phần bị tác nhân vôtrùng trước khi đặt mô cấy lên môi trường tự nhiên nhằm mục đích tránh ảnh hưởng tác động trực tiếp củatác nhân vô trùng lên mô cấy [ 13 ]. 1.2.4. 3. Điều kiện nuôi cấyNhiệt độ : Nhiệt độ có tác động ảnh hưởng thâm thúy đến sinh trưởng và tăng trưởng cây in vitroqua những tiến trình sinh lý như hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độthích hợp nhất thường được dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 27C [ 13 ]. Có nhiều ý kiến đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, chính bới nhiệt độ cao hoàn toàn có thể làmcho tính năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm. Hầu hết, những thínghiệm nuôi cấy mô thực vật được triển khai trong phòng thí nghiệm khống chếnhiệt độ. Những người trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trìkhả năng sinh trưởng khi nhu yếu nhiệt cho cây non còn thấp. Nuôi cấy ở ngănlạnh làm giảm sinh trưởng và làm giảm giá tiền thiết yếu do cấy truyền. 12 Ánh sáng : Ảnh hưởng của ánh sáng hoàn toàn có thể được chia ra trong sự tác động ảnh hưởng của cườngđộ ánh sáng ( bức xạ hoạt động giải trí quang hợp ), thời hạn chiếu sáng ( quang chu kỳ luân hồi ) và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, tăng trưởng của thực vật. Cường độ ánhsáng là tác nhân quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng tác động đến năng lực nuôi cấyin vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường độ ánh sáng nổi bật cho vinhân giống là từ 40 – 80 μmol / m / giây trong nuôi cấy vươn thân, nhưng cườngđộ ánh sáng bên trong những bình nuôi cấy hoàn toàn có thể thấp hơn nhiều. Kiểu nút đậy kín hoàn toàn có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy, những loài cây khác nhau thì nhu yếu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánhsáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính ( 600 – 1200 μmol / m / giây ). Chất lượng ánh sáng là công dụng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy vàkiểu bình cấy được sử dụng. Thông thường trong những phòng nuôi cấy mô sửdụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ. Chất lượng ánh sáng cũnglàm biến hóa phản ứng sinh trưởng của chồi in vitro. Người ta cho rằng chấtlượng ánh sáng là quan trọng trong quá trình thuần hóa cây non và hoàn toàn có thể bị kíchthích bởi giải quyết và xử lý ánh sáng xanh trước khi vận động và di chuyển cây từ nuôi cấy. Chất lượngánh sáng cũng hoàn toàn có thể ảnh hưởng tác động gián tiếp lên sự tăng trưởng chồi, là nguyên nhânlàm những yếu tố môi trường tự nhiên tăng trưởng trong nuôi cấy biến hóa ( Hartmann và ctv, 1997 ). Không khí : Các chất khí có ảnh hưởng tác động lên sự tăng trưởng chồi trong nuôi cấy in vitro baogồm oxy, carbon dioxide và ethylene. Các nhà trồng cây thương mại không nỗlực làm đổi khác mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên toàn bộ sự đóng kín vànắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khácnhau, thường có sự thôi thúc tăng trưởng trải qua lỗ thông khí bị đóng kínhoặc cung ứng qua màng lọc trao đổi khí ( Hartmann và ctv, 1997 ). 131.2.4.4. Môi trường nuôi cấyTrong tổng thể những môi trường tự nhiên nuôi cấy đều gồm có năm thành phần chínhsau đây : – Các muối khoáng đa luợng – Các muối khoáng vi lượng – Các Vitamin – Đường làm nguồn cacbon – Các chất điều hòa sinh trưởngNgoài ra, người ta còn bổ trợ thêm 1 số ít chất hữu cơ có thành phầnxác định như acid amin, EDTA, hoặc không xác lập như nước dừa, dịch chiếtnấm men … vào trong môi trường tự nhiên tùy theo nhu yếu riêng của từng đối tượng người tiêu dùng nuôicấy. Trong hàng trăm môi trường tự nhiên do rất nhiều tác giả ý kiến đề nghị cho nhiều loại câykhác nhau, hoàn toàn có thể phân loại ra 3 thiên nhiên và môi trường : – Môi trường nghèo chất dinh dưỡng : White, Knop. – Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình : B5, Gamborg. – Môi trường giàu chất dinh dưỡng : MS ( Murashige – Skoog ). 1.2.4. 5. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy môChất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinhhọc cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng tác động điều tiết đến những quátrình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinhtrưởng là mẫu sản phẩm trao đổi chất thông thường của khung hình thực vật. Nó đóng vaitrò chủ yếu trong quy trình sinh trưởng, tăng trưởng và những quy trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật so với điều kiệncủa thiên nhiên và môi trường [ 15 ]. 14A uxin : Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng lê dài, cần cho sự tạo mạchdẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng củaống phấn [ 15 ]. Sự luân chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phânhoá, auxin giúp lê dài và phân loại tế bào, những hiện tượng kỳ lạ hướng động, ưu thếngọn, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả …. Auxin kích thích mạnh sự lê dài tế bào diệp tiêu. Sự lê dài của tế bàorễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxingiảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở những nồng độquá cao. Tất cả cây cối đều tổng hợp được chất auxin ( dạng tổng hợp ) tuỳ theogiai đoạn tăng trưởng của chúng. Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiềuchất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm. Một vài chất này đã bộc lộ những đặc tính tựa như như những đặc tính củachất auxin, nhưng thường với những liều lượng thấp hơn, hơn thế nữa chúng ít bị kiểmsoát bởi những enzyme và hoàn toàn có thể có một ảnh hưởng tác động lê dài trong đó có NAA. Tronglĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, haitính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân loại tế bào và sự hìnhthành rễ [ 13 ]. Cytokinin : Các cytokinin kích thích mạnh sự phân loại tế bào với điều kiện kèm theo có sựhiện diện của auxin. Cytokinin cũng giúp sự ngày càng tăng size tế bào và sinhtổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thôi thúc sự hình thànhchồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ [ 11 ]. Sự sinh trưởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rấtkhác nhau, đặc biệt quan trọng là ở những nơi có sự phân loại tế bào mạnh ( ở ngọn thânhay rễ ). Nó hiện hữu hầu hết trong những mô, đặc biệt quan trọng trong hạt, trái và trong rễ. 15T uy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụphát triển yếu do không tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hoá sự phân bào, tuy nhiên tácđộng này chỉ bộc lộ trong sự phối hợp với auxin [ 13 ]. Trong nuôi cấy mô, cytokinin bộc lộ những đặc thù được cho phép tất cả chúng ta xử lý những khó khăntrong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân loại tế bào và định hướngtế bào trong con đường phân hoá [ 13 ]. Gibberellin : Hiệu ứng chính của những gibberellin là lê dài thân, kích thích sự kéo dàilóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân loại tế bào mô vỏ và biểu bì. Kíchthích sự lê dài lóng, vừa do sự lê dài vừa do sự phân loại tế bào thân, là đặctính điển hình nổi bật của gibberellin. Gibberellin liều cao ( hay phối hợp với cytokinin ) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá [ 15 ]. Ảnh hưởng của than hoạt tính : Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 – 3 %. Than hoạt tính có những tácdụng sau : – Hấp thụ độc tố nâu / đen ( hợp chất phenol và melanin ) và những độc tố khôngmàu khác. – Hấp thụ những hợp chất hữu cơ khác ( auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn … ). – Thúc đẩy sự tạo phôi soma. – Ổn định độ pH. 1.2.4. 6. Ảnh hưởng của pH và AgarpH của môi trường tự nhiên nuôi cấy thường ở khoảng chừng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôicấy mô. Nếu pH môi trường tự nhiên thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự pháttriển của mô [ 10 ], [ 14 ]. Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như thể chất keo trong hầu hếtmôi trường dinh dưỡng. Agar là polysaccharide, khối lượng phân tử cao có khảnăng làm đông môi trường tự nhiên. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước
Source: https://laodongdongnai.vn
Category: Nghiên Cứu
